Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...

sahharoosi (puhastatud valkude puhul vastavalt 400 mM rafinoosi või sahharoosi) ning
levaansukraasi sisaldava rakuekstrakti või valgupreparaadi lahjendust. Erinevates
ajapunktides eemaldati 200 μl reaktsioonisegu ning lisati see 400 μl DNSA reaktiivile.
Reaktsiooni peatamiseks kuumutati proove 100°C 5 min ning jahutati jääl. Lisati 800 μl
destilleeritud vett ning mõõdeti lahuse optiline tihedus (OD 540 ) (Visnapuu et al., 2008).
Ensüümiaktiivsus väljendati sahharoosist või rafinoosist 1 min jooksul moodustunud
redutseerivate suhkrute kogusena mikromoolides mg valgu kohta (U/mg).
K m -i ja V max -i määramiseks rafinoosile mõõdeti mutantsetel levaansukraasidel redutseerivate
suhkrute teket järgmistel rafinoosi kontsentratsioonidel: 25, 50, 100, 200 ja 300 mM.
Vastavad kineetilised parameetrid rafinoosile arvutati, nagu on kirjeldatud eespool sahharoosi
korral.
Transfruktosüleeriv aktiivsus
Levaansukraasi polümeriseeriv ehk transfruktosüleeriv aktiivsus (TA) määrati ensümaatilisel
meetodil, mõõtes reaktsioonisegus vaba glükoosi ja fruktoosi hulka, mille vahe kaudu saab
välja arvutada, kui suur osa reageerinud sahharoosis sisalduvast fruktoosist
polümeriseeritakse (van Hijum et al., 2001; Yanase et al., 2002; Toomemaa, 2007).
Inkubatsioonisegu sisaldas 0.02% Na-asiidiga McIllvaine’i puhvrit (pH 6.0), 1200 mM
sahharoosi ja 2.7 U/ml puhastatud levaansukraasi või 50 µl rakulüsaati mutantide puhul,
millel koguaktiivsus praktiliselt puudus. Valkude aktiivsuse arvutusteks kasutati 100 mM
sahharoosist glükoosi tekke järgi aktiivsuse määramisel saadud tulemusi. Reaktsioon toimus
temperatuuril 37°C 20 h jooksul ja lõpetati proovide kuumutamisega 5 min 96°C. Segudest
tehti destilleeritud vette sobivad lahjendused ning pipeteeriti 10 µl proovi küvetti, mis sisaldas
970 μl reaktsioonipuhvrit (5 mM MgCl 2 , 2 mM β-NAD, 1.1 mM ATP, glükoos-6-fosfaadi
dehüdrogenaas 2.8 U, 200 mM imidasoolpuhver; pH 6.9). Määrati optilist tihedust (OD 340 )
heksokinaasi (1.5 U) ning fosfoglükoisomeraasi (1.4 U) lisamisel ja polümeriseeriv aktiivsus
arvutati valemiga ([Glc]-[Fru v ])/[Glc])*100, kus [Glc] näitab glükoosi ja [Fru v ] vaba
polümeriseerimata fruktoosi kontsentratsiooni reaktsioonisegus. TA väljendati protsendina,
mis näitab polümeriseerimisproduktidesse lülitatud fruktoosi osakaalu.
Valgu kontsentratsiooni määramiseks kasutati Lowry meetodit (Lowry et al., 1951).
2.2.6 Mutantsete levaansukraaside puhastamine Ni +2 -afiinsuskromatograafiaga
E. coli BL21(DE3) transformante, mis sisaldasid ekspressioonikonstrukte pURI3-lsc3P222L,
pURI3-lsc3D225A või pURI3-lsc3D225N, kasvatati, mutantse levaansukraasi ekspressioon
indutseeriti ning rakuekstrakt valmistati, nagu on näidatud peatükis 2.2.4. Valkude
19