Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Tabel 3. Levaansukraasi koguaktiivsused rekombinantsetes E. coli BL21(DE3)<br />
rakulüsaatides. Ära on toodud kasutatud plasmiid, <strong>levaansukraasi</strong> kahe paralleelse määramise<br />
tulemusel saadud eriaktiivsus (U/mg) ning standardhälve. Tabeli kolmas lahter näitab<br />
protsentides, kui suure osa moodustas mutantse valgu eriaktiivsus muteerimata valgu<br />
eriaktiivusest.<br />
Levaansukraasi eriaktiivsus Säilinud eriaktiivsus<br />
Plasmiid<br />
(U/mg)*<br />
(%)<br />
pURI3-lsc3 (<strong>Lsc3</strong> wt) 157.7 ± 8.2 100<br />
pURI3-lsc3D62A 0.01 ± 0.001 0.006<br />
pURI3-lsc3D219A 0.03 ± 0.001 0.02<br />
pURI3-lsc3D219N 0.01 ± 0.003 0.006<br />
pURI3-lsc3P222L 107.0 ± 0.05 68<br />
pURI3-lsc3D225A 154.1 ± 3.4 98<br />
pURI3-lsc3D225N 189.6 ± 5.7 120<br />
pURI3-lsc3D303A 0.04 ± 0.002 0.03<br />
pURI3 0.01 ± 0.003 0.006<br />
* Sahharoosi sisaldus reaktsioonisegus oli 100 mM ning reaktsioon toimus 37°C.<br />
Tabel 3 näitab, et mutantidel D62A, D219A, D219N ja E303A oli <strong>levaansukraasi</strong> aktiivsus<br />
peaaegu täielikult kadunud. Samas oli mutandil Pro222Leu säilinud üle poole algse valgu<br />
eriaktiivsusest ja mutant Asp225Ala oli väga sarnane muteerimata <strong>levaansukraasi</strong>ga.<br />
Huvitaval kombel oli mutandil Asp225Asn, millel negatiivselt laetud aspartaat oli asendatud<br />
polaarse ja laadumata asparagiiniga, oli eriaktiivsus ligi viiendiku võrra tõusnud (Tabel 3).<br />
Rakulüsaatidest määratud mutantsete valkude koguaktiivsuste muster langeb üldjoontes<br />
kokku ka E. coli transformantide fenotüüpidega sahharoosi sisaldaval söötmel (Joonis 3) ning<br />
aktiivsuse järgi ilmutatud natiivse polüakrüülamiidgeeli katse tulemustega (Joonis 5A,C). Kui<br />
mutantset <strong>levaansukraasi</strong> ekspresseerivad bakterirakud sünteesisid söötmel ja geelis lahutatud<br />
rakuekstrakides levaani, oli ka vastavas lüsaadis ensüümi eriaktiivsus palju suurem kui lima<br />
mittesünteesival transformandil.<br />
Selleks, et kontrollida, kas mutantsete valkude substraadispetsiifikas on toimunud muutusi,<br />
määrasime rekombinantsetest rakulüsaatidest 100 mM sahharoosist ja rafinoosist<br />
redutseerivate suhkrute moodustumist (pt. 2.2.5) (Tabel 4). Kui sahharoosist tekivad<br />
<strong>levaansukraasi</strong> reaktsiooni käigus glükoos ja fruktoos, siis rafinoosist vabanevad fruktoos ja<br />
melibioos. Kõik mainitud suhkrud on redutseerivate omadustega ning neid saab määrata<br />
DNSA reaktiiviga. Eelnevalt on meie töögrupis näidatud, et sahharoos on <strong>Lsc3</strong> valgule<br />
sobivam substraat kui rafinoos: 100 mM sahharoosist moodustub ~50% rohkem<br />
redutseerivaid suhkruid kui 100 mM rafinoosist (Visnapuu et al., 2008).<br />
28
Change language