Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
Tabel 4. Levaansukraaside 100 mM sahharoosi ja rafinoosi hüdrolüüsiv aktiivsus (U/mg)<br />
rekombinantsetes rakulüsaatides määratuna redutseerivate suhkrute tekke järgi. Arvutatud on<br />
rafinoosi ja sahharoosi kasutamise suhe (%).<br />
Plasmiid<br />
Eriaktiivsus<br />
sahharoosiga (U/mg)<br />
Eriaktiivsus<br />
rafinoosiga (U/mg)<br />
Rafinoosi ja<br />
sahharoosi<br />
kasutamise suhe (%)<br />
pURI3-lsc3 (<strong>Lsc3</strong> wt) 291.2 ± 9.5 127.0 ± 2.7 44<br />
pURI3-lsc3P222L 165.3 ± 4.3 74.0 ± 4.1 45<br />
pURI3-lsc3D225A 108.1 ± 1.2 54.8 ± 0.6 51<br />
pURI3-lsc3D225N 319.1 ± 0.8 148.0 ± 0.2 46<br />
Tabelist 4 on näha, et mutantsete valkude Pro222Leu, Asp225Ala ning Asp225Asn võime<br />
kasutada substraadina rafinoosi on väga sarnane muteerimata <strong>Lsc3</strong> valguga – rafinoosist tekib<br />
redutseerivaid suhkruid ligi poole vähem kui sahharoosist. Kuna <strong>Lsc3</strong> mutantidel Asp62Ala,<br />
Asp219Asn, Asp219Ala ja Glu303Ala <strong>levaansukraasi</strong> aktiivsus rakulüsaatides praktiliselt<br />
puudus, siis ei olnud neil võimalik sahharoosi ja rafinoosi kasutamise suhet määrata.<br />
2.3.2.2 Mutantsete valkude puhastamine ja nende kineetilised parameetrid<br />
Valkude puhastamiseks kasvatati vastavad E. coli transformandid ja indutseeriti neil<br />
<strong>levaansukraasi</strong> tootmine ning valmistati rakulüsaat, nagu on näidatud peatükis 2.2.4. N-<br />
terminaalse His 6 -järjestusega mutantsed <strong>Lsc3</strong> valgud Pro222Leu, Asp225Ala ja Asp225Asn<br />
puhastati Ni +2 -afiinsuskromatograafiaga ning seondunud mutantsed <strong>levaansukraasi</strong>d elueeriti<br />
Ni-maatriksilt 500 mM imidasooli sisaldava puhvriga. Levaansukraasi sisaldavad fraktsioonid<br />
segati kokku ning dialüüsiti McIllvaine’i puhvris (pH 6.0) (pt. 2.2.6). Kõikidest valkude<br />
puhastamise etappidest võeti proovid (5 µl), mida analüüsiti denatureerivas<br />
polüakrüülamiidgeelis (SDS-PAGE) (pt. 2.2.7). Vastavad geelid on ära toodud LISA-s 2.<br />
Nägime, et valkude puhastamise saagis oli hea ning elueeritud levaansukraas moodustas geelil<br />
ühe konkreetse bändi. Sellest võib järeldada, et preparaat sisaldas ainult <strong>levaansukraasi</strong> ning<br />
mitte teisi E. coli valke, mis võiksid edasisi katseid segada.<br />
Kontrollisime puhastatud valkudega, kas mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de substraadispetsiifikas<br />
võis olla toimunud muutusi. Tulemused on näidatud Tabelis 5.<br />
29
Change language