Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalÃ¼Ã¼tilise ...

More documents

Recommendations

Info

KOKKUVÕTE Levaansukraasid on glükosiidi hüdrolaaside perekonda 68 kuuluvad rakuvälised ensüümid, mis sünteesivad fruktooligosahhariide ja polümeerset levaani. Levaansukraase on leitud nii gramnegatiivsetest kui ka -positiivsetest bakteritest, kuid need ensüümid võivad valgujärjestuste poolest üsna palju erineda. Sellele vaatamata on levaansukraasidel väga sarnane struktuur ning aktiivtsenter. On leitud, et levaansukraasid, teised fruktosüüli transferaasid ning ka invertaasid on β-lehtedest koosnevad viielabalise β-propelleri ehitusega, mille keskel on happelistest aminohapetest tasku, kuhu seondub substraat. Mitmete bakterite levaansukraase on muteeritud, et teha kindlaks, millised aminohapped ja piirkonnad on ensüümi töös olulised. Substraadi sidumiseks ja hüdrolüüsiks on vajalikud kolm aminohapet (nn katalüütiline kolmik), mille moodustavad kaks aspartaati ja glutamaat, mis on konserveerunud kõigis seni uuritud levaansukraasides. Eelnevalt on meie töögrupis kirjeldatud Lsc3 valgu biokeemilisi omadusi ja näidatud, et Lsc3 kasutab substraadina nii sahharoosi kui ka rafinoosi ja sünteesib neist fruktooligosahhariide ja ka heterooligosahhariide (Visnapuu et al., 2008; 2009; T. Visnapuu, avaldamata andmed). Antud töös keskenduti P. syringae pv. tomato DC3000 levaansukraasi Lsc3 koht-suunatud muteerimisele ja vastavate mutantide analüüsile, et teha kindlaks, millised aminohapped võiksid moodustada ensüümi katalüütilise kolmiku. Töö tulemused ja järeldused olid järgmised: 1. Lsc3 valgu järjestus joondati teiste gramnegatiivsetest bakteritest pärinevate levaansukraasidega ja leiti, et Asp62, Asp219 ja Glu303 joonduvad kohakuti teiste levaansukraaside katalüütilise kolmiku aminohapetega. 2. Mutantsed lsc3 geenid, mis kodeerivad Lsc3 valgus asendusi Asp219Ala, Asp219Asn, Asp225Ala ja Asp225Asn, kloneeriti ekspressioonivektorisse pURI3. 3. Koht-suunatud muteerimisega tehti konstruktid Lsc3 valgu mutantide Asp62Ala ja Glu303Ala ekspressiooniks pURI3 vektoris. 4. Mutantseid Lsc3 valke Asp62Ala, Asp219Ala, Asp219Asn, Pro222Leu, Asp225Ala, Asp225Asn, Glu303Ala ekspresseeriti E. coli’s ning iseloomustati biokeemiliste näitajate alusel. 5. Mutandid Asp62Ala, Asp219Ala ja Glu303Ala kaotasid peaaegu täielikult võime sahharoosi lagundada ja levaani toota. Samas aminohapete Pro222 ja Asp225 asendused ei muutnud oluliselt ensüümi omadusi, millest järeldame, et need aminohapped ei ole olulised Lsc3 katalüüsis. 6. Meie tulemuste kohaselt moodustavad Lsc3 valgu katalüütilise kolmiku Asp62, Asp219 ja Glu303. 34
Identification of catalytic triad amino acids in Pseudomonas syringae pv. tomato levansucrase Lsc3 by mutational analysis Triin Elmi SUMMARY Levansucrases are bacterial exoenzymes belonging to glycoside hydrolase family 68. They catalyse the transfer of fructosyl residue from substrate to a variety of acceptors including water (sucrose hydrolysis), sucrose (oligofructose synthesis) and oligofructans (polymerase reaction). It has been shown that fructans, like polysaccharidic levan, are involved in fitness and survival of bacteria in the environment and in phytopathogenesis, e.g. in development of the dental plaque and biofilm. Moreover, fructooligosaccharides act as health-promoting prebiotics in the gut of humans and animals. Levansucrases and other fructosyl transferases and also invertases have a common five-blade β-propeller fold containing a catalytic pocket with three conserved acidic amino acids. The catalytic triad is composed of catalytic nucleophile (Asp), transition state stabilizer (Asp) and general acid/base catalyst (Glu). The aim of this study was to identify catalytic triad amino acids in the active centre of P. syringae pv. tomato DC3000 levansucrase Lsc3. Using sequence alignment of Lsc3 and levansucrases from other Gram-negative bacteria, Asp62, Asp219 and Glu303 were predicted to form the catalytic triad. We performed site-directed mutagenesis of the lsc3 gene to substitute Asp62 and Glu303 residues in Lsc3 protein with alanins and cloned the mutated lsc3 genes to pURI3 expression vector. Previously constructed mutant lsc3 genes (encoding substitutions Asp219Ala, Asp219Asn, Asp225Ala, Asp225Asn) were also cloned into pURI3 vector. As a result of this study, several mutant levansucrases (Asp62Ala, Asp219Ala, Asp219Asn, Pro222Leu, Asp225Ala, Asp225Asn, Glu303Ala) were expressed in Escherichia coli and their properties were characterized. Mutation of Asp62, Asp219 and Glu303 virtually abolished catalytic activity of Lsc3. Substitution of Pro222 and Asp225 had no significant effect on catalytic properties of Lsc3. We conclude that Asp62, Asp219 and Glu303 are at key position in Lsc3 protein of P. syringae pv. tomato and most probably comprise catalytic triad of the active site. 35
Page 1 and 2: TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOG
Page 3 and 4: KASUTATUD LÜHENDID ah - aminohape
Page 5 and 6: 1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 1.1 Glükos
Page 7 and 8: varieeruv piirkond, konserveerunud
Page 9 and 10: B. subtilis’e levaansukraas SacB
Page 11 and 12: 1.3.2 Fruktosüültransferaaside mu
Page 13 and 14: 2. EKSPERIMENTAALOSA 2.1 Töö eesm
Page 15 and 16: vastavalt kas päripraimer T7 (5’
Page 17 and 18: lõik. Levaansukraasi geeni teise p
Page 19 and 20: sahharoosi (puhastatud valkude puhu
Page 21 and 22: Denatureeriv polüakrüülamiidgeel
Page 23 and 24: 80 90 100 110 120 130 140 ....|....
Page 25 and 26: 2.3.2 Levaansukraasi mutantide isel
Page 27 and 28: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Page 29 and 30: Tabel 4. Levaansukraaside 100 mM sa
Page 31 and 32: substraadiks oli rafinoos. Afiinsus
Page 33: eristada. Valkude Lsc3 D225A, D225N
Page 37 and 38: the plant phatogens Pseudomonas syr
Page 39 and 40: Visnapuu, T. (2007). Levaansukraasi
Page 41 and 42: LISA 2 Ni +2 -afiinsuskromatograafi

Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalÃ¼Ã¼tilise ...

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?