Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...

Leiti, et Lsc3 kasutab substraadina hüdrolüüsi- ja polümerisatsiooniproduktide tootmiseks
lisaks sahharoosile ka rafinoosi ja stahhüoosi ning ensüümi afiinsus sahharoosile oli ligi kaks
korda suurem kui teistele substraatidele (Visnapuu, 2007; Visnapuu et al., 2008). Lisaks
polümeersele levaanile toodab Lsc3 ka lühemaid oligosahhariide, millel võib olla prebiootilist
toimet (Visnapuu et al., 2009).
Käesoleva töö eesmärgiks oli levaansukraasi Lsc3 võimalike katalüüsis oluliste aminohapete
ennustamine, vastavate mutantide konstrueerimine ja mutatsioonide mõju hindamine Lsc3
koguaktiivsusele, katalüütilistele parameetritele ja polümerisatsiooniproduktide tekkele.
Kõigepealt joondati Z. mobilis’e, G. diazotrophicus’e ja Rahnella aquatilis’e levaasukraaside
järjestused Lsc3-ga (Joonis 2). Järjestused valiti gramnegatiivsete bakterite levaansukraaside
hulgast, sest need valgud on suhteliselt sarnased ja joonduvad omavahel hästi.
Grampositiivsete bakterite levaansukraasid on aga pikemad, järjestuselt gramnegatiivsete
bakterite levaansukraasidest rohkem erinevad ja seetõttu halvemini nendega joonduvad. Nii P.
syringae DC3000 Lsc3 valgu kui ka teiste gramnegatiivsete bakterite levaansukraaside
valgujärjestused võeti CAZy andmebaasist (http://www.cazy.org). Joonduseks kasutati
programmi BioEdit moodulit ClustalW (Thompson et al., 1994). Vastavate valkude joondus
on esitatud Joonisel 2 ning välja on toodud konserveerunud katalüütilised aminohapped.
Valkude struktuuri ja funktsiooni vaheliste seoste uurimiseks kasutatakse tihti koht-suunatud
mutageneesi. Selleks tekitatakse valku kodeerivasse geeni punktmutatsioonid, millega
vahetub aminohappe koodon, ning mutantseid valke iseloomustades hinnatakse vastava
aminohappe asenduse mõju. Näiteks G. diazotrophicus’e LsdA valgu kristallstruktuuri alusel
ennustati, et katalüütilise kolmiku aminohapped on Asp135 (nukleofiil), Asp309
(stabiliseerija) ja Glu401 (alus-hape katalüüsija) (Martinez-Fleites et al., 2005) (Tabel 1;
Joonis 1 ja 2). LsdA koht-suunatud mutageneesiga on eksperimentaalselt tõestatud Asp309 ja
Asp135 olulisus: mutantidel Asp309Asn ja Asp135Asn oli väga tugevasti langenud
katalüüsivõime (vt. pt. 1.3.2) (Batista et al., 1999; Martinez-Fleites et al., 2005).
Ennustasime levaansukraasi valkude joonduse abil (Joonis 2) võimalikud Lsc3 valgu
katalüütilise kolmiku aminohappeid: nukleofiil Asp62, RDP-motiivis asuv stabiliseerija
Asp219 ja alus-hape katalüüsija Glu303.
22