Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...

levaansukraasides, kuid gramnegatiivsetes bakterites on homoloogilises positsioonis histidiin
– His296 Z. mobilis’e ja His419 G. diazotrophicus’e levaansukraasil (Yanase et al., 2002).
Sahharoosiga kompleksis oleval mutantse SacB (Glu342Ala) analüüsil näidati, et ensüümi -1
ja +1 alapiirkonda seonduvad vastavalt fruktoosi- ja glükoosijääk. -1 piirkonnal on kõrge
spetsiifilisus fruktoosijäägi seondumiseks, kuid +1 piirkonda võib seonduda glükoosijääk, mis
on pärit doonorsubstraadilt, aga ka mõni muu sahhariidne aktseptormolekul (Ozimek et al.,
2006). On näidatud, et SacB -1 alapiirkonda kuuluvad nukleofiil Asp86 ja stabiliseerija
Asp247. Alus-hape katalüüsija Glu342 moodustab tugeva sideme konserveerunud RDPmotiivis
asuva arginiiniga Arg246 ja vesiniksideme türosiiniga positsioonis 411, mis
omakorda moodustab tugeva H-sideme Arg360-ga. Nii Arg360 kui ka Glu340 moodustavad
+1 piirkonnas glükosüülijäägiga H-sideme (Joonis 1B ) (Meng ja Fütterer, 2008).
Gramnegatiivsetest bakteritest pärinevad levaansukraasid ei vaja katalüüsiks metallilisi
kofaktoreid, kuid B. subtilis’e enüümi puhul on näidatud Ca 2+ seondumispiirkonna olemasolu.
Leiti, et Ca 2+ -ioonide seondumist vahendab Asp339 (Meng ja Fütterer, 2003).
Valgujärjestuste joondus GH68 perekonna ensüümidega näitas, et aminohapped, mis on
vajalikud Ca 2+ seondumisel, on konserveerunud enamikes grampositiivsete bakterite
levaansukraasides, kuid puuduvad gramnegatiivsete mikroobide ensüümidel (Ozimek et al.,
2005; van Hijum et al., 2006). Gramnegatiivsetel bakteritel võib sarnane struktuuri
stabiliseeriv funktsioon olla disulfiidsildadel. Näiteks G. diazotrophicus’e LsdA valgu
uurimisel leiti üks disulfiidsild (Martinez-Fleites et al., 2005).
G. diazotrophicus’e levaansukraas LsdA koosneb 584 aminohappest, millest 30 ah pikkune
N-terminaalne järjestus moodustab signaalpeptiidi, mis eemaldatakse tüüp II sekretsiooni
käigus. LsdA sünteesib suures kogustes tri- ja tetrasahhariide (FOS-e), kuid polüsahhariidset
levaani tekib vähe (Martinez-Fleites et al., 2005; Velazquez-Hernandez et al., 2008).
Üldiselt on LsdA kristallstruktuur sarnane SacB-ga, moodustades viielabalise β-propelleri,
mille keskel paikneb konserveerunud aktiivtsenter (Joonis 1C, D). LsdA aminohappeline
järjestus on B. subtilise SacB valguga 26% ulatuses identne. β-lehtede ja enamiku α-heeliksite
paiknemine on mõlemal valgul sarnane. LsdA mutatsioonianalüüsiga on tõestatud, et
katalüütilise kolmiku aminohapped on Asp135 (nukleofiil), Asp309 (stabiliseerija) ja Glu401
(alus-hape katalüüsija), mis paiknevad β-lehtede esimestel (sisemistel) β-ahelatel (Tabel 1;
Joonis 1D) (Martinez-Fleites et al., 2005).
A. japonicus’e fruktosüültransferaasil AjFT on levaansukraasidele sarnane N-terminaalne 5-
labaline β-propelleristruktuur koos katalüütilise tsentriga, kuid lisaks on sellel valgul ka C-
terminaalne kihiline struktuur, mis koosneb kahest 6-ahelalisest β-lehest (Chuankhayan et al.,
2010). Arvatavasti aitab see lisadomään valku stabiliseerida (Lammens et al., 2009).
10