Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalÃ¼Ã¼tilise ...

More documents

Recommendations

Info

saagist, ja purustati ultraheliga. Segu tsentrifuugiti (2400 g, 20 min, 4°C) ning supernatanti kasutati levaansukraaside allikana. 2.2.5 Levaansukraasi aktiivsuse määramine Levaansukraasi koguaktiivsuse määramine glükoosi tekke järgi Levaansukraasi koguaktiivsus määrati glükoosi moodustumise järgi sahharoosist, kasutades Glycose Liquicolor-i reaktiivi (Human GmbH, Saksamaa) ja eelnevalt väljatöötatud metoodikat (Visnapuu et al., 2008). Reaktsioonisegu sisaldas 0.02% Na-asiidiga McIllvaine’i puhvrit (pH 6.0), 100 mM sahharoosi ning rakuekstrakti või puhastatud valgu sobivat lahjendust. Reaktsioon tehti 37°C ning sobivatel ajapunktidel võeti 50 µl reaktsioonisegu, pipeteeriti see 150 µl Tris (trishüdroksümetüülaminometaan) puhvrile (200 mM; pH 8.3) ning reaktsioon peatati proovi kuumutamisega 5 min 96°C. Tekkinud glükoosi hulk määrati Glycose Liquicolor-i reaktiiviga vastavalt tootjapoolsetele soovitustele. Ensüümi koguaktiivsus väljendati sahharoosi hüdrolüüsil vabanenud glükoosi kogusena mikromoolides ühes minutis mg valgu kohta (U/mg). Puhastatud mutantsete levaansukraaside afiinsus sahharoosile (K m ), maksimaalne reaktsioonikiirus (V max ) ja rafinoosi inhibitsioonikonstant K i määrati glükoosi tekke järgi. Reaktsioonisegud sisaldasid erineva kontsentratsiooniga sahharoosi (15, 20, 30, 50, 100 või 200 mM), asiidiga McIllvaine’i puhvrit ja samas puhvris lahjendatud puhastatud levaansukraasi. K i määramiseks mõõdeti levaansukraaside koguaktiivsust erinevatel sahharoosi kontsentratsioonidel, kui segusse oli lisatud 100 mM rafinoos. Mutantsete valkude kineetilised parameetrid arvutati Michaelis-Menteni võrrandi alusel, kasutades programmi SigmaPlot 2001 (SYSTAT, USA) ensüümikineetika moodulit (Enzyme Kinetics Module 1.1). Katalüütiline konstant k cat (1/min) arvutati võttes arvesse vastava valgu V max väärtust ja ensüümi molekulmassi. Molekulmassid valkudele Pro222Leu (49589 g/mol), Asp225Ala (49529 g/mol) ja Asp225Asn (49572 g/mol) arvutati ExPasy serveris (http://expasy.org/tools/pi_tool.html). Katalüütiline efektiivsus (1/M*min) leiti k cat ja K m jagatise kaudu. Redutseerivate suhkrute määramine Levaansukraaside rafinoosi ja sahharoosi, mis on mõlemad mitteredutseerivad suhkrud, hüdrolüüsiva aktiivsuse võrdlemiseks määrati redutseerivate suhkrute teket rakuekstraktide ja puhastatud Lsc3 valkudega, kasutades 3,5-dinitrosalitsüülhappe (DNSA) reaktiivi (Miller, 1959). Reaktsioon toimus temperatuuril 37°C ning inkubatsioonisegu (1.5 ml) sisaldas 0.02% Na-asiidiga McIllvaine’i puhvrit (pH 6.0), kuhu oli lisatud 100 mM rafinoosi või 100 mM 18
sahharoosi (puhastatud valkude puhul vastavalt 400 mM rafinoosi või sahharoosi) ning levaansukraasi sisaldava rakuekstrakti või valgupreparaadi lahjendust. Erinevates ajapunktides eemaldati 200 μl reaktsioonisegu ning lisati see 400 μl DNSA reaktiivile. Reaktsiooni peatamiseks kuumutati proove 100°C 5 min ning jahutati jääl. Lisati 800 μl destilleeritud vett ning mõõdeti lahuse optiline tihedus (OD 540 ) (Visnapuu et al., 2008). Ensüümiaktiivsus väljendati sahharoosist või rafinoosist 1 min jooksul moodustunud redutseerivate suhkrute kogusena mikromoolides mg valgu kohta (U/mg). K m -i ja V max -i määramiseks rafinoosile mõõdeti mutantsetel levaansukraasidel redutseerivate suhkrute teket järgmistel rafinoosi kontsentratsioonidel: 25, 50, 100, 200 ja 300 mM. Vastavad kineetilised parameetrid rafinoosile arvutati, nagu on kirjeldatud eespool sahharoosi korral. Transfruktosüleeriv aktiivsus Levaansukraasi polümeriseeriv ehk transfruktosüleeriv aktiivsus (TA) määrati ensümaatilisel meetodil, mõõtes reaktsioonisegus vaba glükoosi ja fruktoosi hulka, mille vahe kaudu saab välja arvutada, kui suur osa reageerinud sahharoosis sisalduvast fruktoosist polümeriseeritakse (van Hijum et al., 2001; Yanase et al., 2002; Toomemaa, 2007). Inkubatsioonisegu sisaldas 0.02% Na-asiidiga McIllvaine’i puhvrit (pH 6.0), 1200 mM sahharoosi ja 2.7 U/ml puhastatud levaansukraasi või 50 µl rakulüsaati mutantide puhul, millel koguaktiivsus praktiliselt puudus. Valkude aktiivsuse arvutusteks kasutati 100 mM sahharoosist glükoosi tekke järgi aktiivsuse määramisel saadud tulemusi. Reaktsioon toimus temperatuuril 37°C 20 h jooksul ja lõpetati proovide kuumutamisega 5 min 96°C. Segudest tehti destilleeritud vette sobivad lahjendused ning pipeteeriti 10 µl proovi küvetti, mis sisaldas 970 μl reaktsioonipuhvrit (5 mM MgCl 2 , 2 mM β-NAD, 1.1 mM ATP, glükoos-6-fosfaadi dehüdrogenaas 2.8 U, 200 mM imidasoolpuhver; pH 6.9). Määrati optilist tihedust (OD 340 ) heksokinaasi (1.5 U) ning fosfoglükoisomeraasi (1.4 U) lisamisel ja polümeriseeriv aktiivsus arvutati valemiga ([Glc]-[Fru v ])/[Glc])*100, kus [Glc] näitab glükoosi ja [Fru v ] vaba polümeriseerimata fruktoosi kontsentratsiooni reaktsioonisegus. TA väljendati protsendina, mis näitab polümeriseerimisproduktidesse lülitatud fruktoosi osakaalu. Valgu kontsentratsiooni määramiseks kasutati Lowry meetodit (Lowry et al., 1951). 2.2.6 Mutantsete levaansukraaside puhastamine Ni +2 -afiinsuskromatograafiaga E. coli BL21(DE3) transformante, mis sisaldasid ekspressioonikonstrukte pURI3-lsc3P222L, pURI3-lsc3D225A või pURI3-lsc3D225N, kasvatati, mutantse levaansukraasi ekspressioon indutseeriti ning rakuekstrakt valmistati, nagu on näidatud peatükis 2.2.4. Valkude 19
Page 1 and 2: TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOG
Page 3 and 4: KASUTATUD LÜHENDID ah - aminohape
Page 5 and 6: 1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 1.1 Glükos
Page 7 and 8: varieeruv piirkond, konserveerunud
Page 9 and 10: B. subtilis’e levaansukraas SacB
Page 11 and 12: 1.3.2 Fruktosüültransferaaside mu
Page 13 and 14: 2. EKSPERIMENTAALOSA 2.1 Töö eesm
Page 15 and 16: vastavalt kas päripraimer T7 (5’
Page 17: lõik. Levaansukraasi geeni teise p
Page 21 and 22: Denatureeriv polüakrüülamiidgeel
Page 23 and 24: 80 90 100 110 120 130 140 ....|....
Page 25 and 26: 2.3.2 Levaansukraasi mutantide isel
Page 27 and 28: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Page 29 and 30: Tabel 4. Levaansukraaside 100 mM sa
Page 31 and 32: substraadiks oli rafinoos. Afiinsus
Page 33 and 34: eristada. Valkude Lsc3 D225A, D225N
Page 35 and 36: Identification of catalytic triad a
Page 37 and 38: the plant phatogens Pseudomonas syr
Page 39 and 40: Visnapuu, T. (2007). Levaansukraasi
Page 41 and 42: LISA 2 Ni +2 -afiinsuskromatograafi

Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalÃ¼Ã¼tilise ...

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?