Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...

vastavalt kas päripraimer T7 (5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’) ja vastupraimer
D62ARev (5’ CATGGTGGCCCAGATGAAT 3’) või päripraimer E303AFw (5’
TGATCAGACCGCGCGCC 3’) ja vastupraimer Ampsaba (5’ CTGAGATAGGTGCCTCAC
3’). Muteerimispraimerid D62ARev ja E303AFw sisaldavad selliseid lämmastikaluse
vahetusi (praimeri järjestuses alla joonitud), et Asp62 ja Glu303 asendatakse koodoni
muutuse kaudu alaniiniga (vt. Tabel 2). PCR-i produktid (megapraimerid) lahutati
elektroforeesiga (vt. pt. 2.2.7). Vastavalt 320 ap ja 555 ap pikkused DNA fragmendid lõigati
geelist välja ning puhastati Mo Bio (USA) Ultra Clean TM 15 DNA puhastamise komplektiga
tootjapoolse protokolli järgi. Seejärel tehti megapraimerite pikendamiseks uus PCR.
Reaktsioonisegu sisaldas vastavat megapraimerit, matriits-DNA-d (pURI3-lsc3), 1x Pfu
puhvrit, 0.04 mM dNTP, 4 mM MgSO 4, 0.05 U/μl Pfu DNA polümeraasi ning programm oli
järgmine:
1. DNA ahelate denatureerimine 96°C 2 minutit;
2. Megapraimeri paardumine DNA ahelaga 60°C 2 minutit;
3. DNA süntees 72°C 5 minutit;
Tsüklite arv: 10.
Proove inkubeeriti restriktaasiga DpnI (lõppkonts. 0.2 U/µl) 90 min 37°C, et lagundada segus
algne metüleeritud matriits-DNA. Mutatsiooni sisaldav lsc3 fragment (1369 ap) paljundati
segust praimeritepaariga Lsc3pURI3Fw (5’
CATCATGGTGACGATGACGATAAGATGTACAATAGCAACTCTGCTGTAA 3’) ja
Lsc3pURI3Rev (5’
AAGCTTAGTTAGCTATTATGCGTAGTTCTTCAGGTATGGGAACGGCGTG 3’).
Kaldkirjas on pURI3 vektoriga komplementaarne järjestus ning ülejäänud osa praimerist
seondub lsc3 geeni otstele. Produkti olemasolu kontrolliti 1% agaroosgeelil ning puhastati
geelist Mo Bio Ultra Clean TM 15 komplektiga.
Mutatsiooni sisaldava lsc3 geeni liitmiseks pURI3 vektorisse kasutasime restriktaasi- ja
ligeerimisvaba PCR-i põhist kloneerimist (Geiser et al., 2001; Rivas et al., 2007). pURI3
vektoriga komplementaarsete otstega lsc3 geen paljundati plasmiididelt pHIPMalpromlsc3D219A,
pHIPMalprom-lsc3D219N, pHIPMalprom-lsc3D225A, pHIPMalpromlsc3D225N
praimeritega Lsc3pURI3Fw ja Lsc3pURI3Rev või saadi suunatud muteerimisega,
nagu on kirjeldatud eespool. Saadud mutantsed lsc3 fragmendid lahutati agaroosgeelis,
puhastati ja tehti ekstensioonietapp, kus lsc3 geen kloneerub pURI3 vektorisse.
Reaktsioonisegu sisaldas puhastatud lsc3 fragmenti, vektorit pURI3, 0.1 mM dNTP, 1x Pfu
puhvrit, 4 mM MgSO 4 , 0.05 U/μl Pfu DNA polümeraasi ning programm oli järgmine:
1. DNA ahelate denatureerimine 95°C 1 minut;
15