Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...

puhastamisel lähtuti E. Kallase kasutatud metoodikast, mida kohandati Lsc3 valgule (Kallas,
2010). Saadud 10 ml rakulüsaadile lisati 400 μl Ni 2+ -NTA agaroosi (Hispanagar, Hispaania)
ja inkubeeriti 2 h 4°C end-over-end segajal (Bio RS-24, BioSan, Läti), et levaansukraas
seonduks maatriksile. Ni 2+ -maatriks tsentrifuugiti põhja (380 g, 1 min, 4°C) ning pesti kaks
korda 5 ml sonikeerimispuhvriga. Ni 2+ -maatriks suspendeeriti 2 ml sonikeerimispuhvris ja
kanti ilma membraanita RNA minikolonnidele ning tsentrifuugiti (380 g, 1 min, 4°C).
Seejärel levaansukraasi valgud elueeriti maatriksilt 1 ml elueerimispuhvriga (500 mM
imidasool, 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10% glütserool; pH 6.0). Levaansukraasi
sisaldavad eluaadid viidi Spectra/Por 3 dialüüsimembraani, mis ei lase läbi suuremaid
molekule kui 3500 daltonit (Da) (Mw cut-off 3.5 kDa; Spectrum Laboratories, Holland).
Valgulahust dialüüsiti 4°C 24 h Na-asiidi sisaldavas McIllvaine’i puhvris (pH 6.0). Seejärel
kaeti membraanid polüetüleenglükooliga, mille molekulmass on 8000 Da (PEG8000;
SIGMA, USA), ning kontsentreeriti 4°C, kuni lahuse maht vähenes ligi kaks korda. Saadud
levaansukraasi lahust kasutati puhta valgupreparaadina. Kõikidest valgu puhastamise
etappidest võeti proovid ning neid analüüsiti denatureerival polüakrüülamiidgeelil (SDS-
PAGE) (pt. 2.2.7).
2.2.7 Geelelektroforees
DNA fragmentide lahutamiseks ja plasmiidse DNA kontrolliks kasutati elektroforeesi 1%
agaroosgeelil 0.5 x TAE puhvris (40 mM Tris-atsetaatpuhver, 1 mM EDTA; pH 8.2).
Agaroosgeel sisaldas etiidiumbromiidi (0.35 μg/ml). Geelile kantavatele segudele lisati
glütserooli sisaldavat geelivärvi (1x DNA Loading Dye, Fermentas) ja geelelektroforees
toimus toatemperatuuril 0.5 x TAE puhvris ning pingel 10 V/cm. DNA fragmendid tehti
nähtavaks ultraviolettvalguses UV Transillumnator-iga (UVP, USA). Produktide suuruse
määramiseks kasutati GeneRuler 1 kb DNA markerit (Fermentas).
Rakulüsaatides sisalduvad valgud lahutati nii denatureeriva (SDS) kui ka natiivse
(mittedenatureeriva) polüakrüülamiidgeelelektroforeesiga (PAGE). Natiivne 7.5% PAGE geel
valmistati standardprotokolli järgi (Sambrook et al., 1989; Visnapuu et al., 2008). Geeli rajale
kanti 20 μg rakuekstrakti, mis oli suspendeeritud 50% glütserooliga broomfenoolsinise
lahuses. Geel voolutati Hoefer-i (USA) geelelektroforeesi süsteemiga madalal temperatuuril
(4°C) 10 V/cm ja voolutuspuhvrina kasutati 0.5 x TBE puhvrit (pH 8.3). Tehti paralleelleselt
2 natiivset PAGE geeli – üks ilmutati aktiivsuse järgi toatemperatuuril 10% sahharoosiga
McIllvaine’i puhvris (pH 6.0) ligi 20 h ning teine geel värviti valgule Coomassie Brilliant
Blue G250 (Serva, Saksamaa) lahusega.
20