Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...

lõik. Levaansukraasi geeni teise poole 938 ap pikkune fragment amplifitseeriti praimeritega
Lsc1ja3Fw1 (5’ GCGATCGCCAAAGTACG 3’) ning Ampsaba. Seejärel tehti proovidele
ExoI-SAP töötlus 15 min 37°C, kus reaktsioonisegusse lisati aluseline fosfataas (Shrimp Acid
Phosphatase – SAP; Fermentas; lõppkonts. 0.2 U/µl) ja eksonukleaas ExoI (Fermentas; 0.4
U/µl), et lagundada segusse allesjäänud praimerid ja algne DNA. Järgnevalt DNA sadestati
96° etanooliga ja proovid valmistati vastavalt tootjapoolsele soovitusele. Sekveneeriti ABI
3130xl Cenetic Analyser või ABI 3730xl DNA Analyzer sekvenaatoriga (Applied
Biosystems, Kanada).
2.2.4 Transformantide kasvatus, levaansukraaside ekspresseerimine ja
rakuekstraktide tegemine
Levaansukraaside ekspresseerimiseks viidi mutantset või algset levaansukraasi geeni
sisaldavad pURI3 plasmiidid ja ilma inserdita pURI3 vektor elektroporatsiooniga E. coli
ekspressioonitüvesse BL21(DE3) (pt. 2.2.3). Transformante kasvatati ampitsilliini (lõppkonts.
0.15 mg/ml) sisaldavas LB tard- või vedelsöötmes 37°C. Vedelkultuure aereeriti loksutil.
Fenotüüpide uurimiseks külvati transformandid 10% sahharoosiga LB Amp söötmetassidele,
kasvatati 37°C üleöö ja seejärel inkubeeriti tasse kuni 7 p toatemperatuuril (~23°C).
Rakuekstraktide tegemiseks külvati muteeritud või algset levaansukraasi geeniga plasmiidi
sisaldavad E. coli BL21(DE3) kolooniad 5 ml LB Amp vedelsöötmesse, kasvatati üleöö ning
kultuurid külvati 30 ml LB Amp söötmesse algtihedusega 0.05 (OD 600 ) ja kasvatati opilise
tiheduse väärtuseni ~0.5. Levaansukraaside ekspressiooni aktiveerimiseks lisati söötmesse
IPTG-d (isopropüül-β-D-1-tiogalaktopüranosiid) (lõppkonts. 0.5 mM) ja transformante
kasvatati madalama temperatuuriga (22°C) loksutil 20 h. Bakterirakud sadestati
tsentrifuugimisega (2400 g, 10 min, 4°C), neid pesti kaks korda 50 mM K-fosfaatpuhvriga
(pH 7.0), suspendeeriti 0.02% Na-asiidiga McIllvaine’i puhvris (130 mM Na 2 HPO 4 ja 40 mM
sidrunhape; pH 6.0) ning purustati ultraheliga (Ultrasonic Homogenizer 4710, Cole-Parmer
Instrument Co., USA). Tahke fraktsioon sadestati tsentrifuugimisega (13700 g, 4°C) 20
minuti jooksul ning supernatanti kasutati rakuekstraktina. Rakuekstrakte hoiti jääl või
külmutati -20°C.
Mutantsete levaansukraaside puhastamiseks külvati E. coli BL21(DE3) transformandid 200
ml LB Amp vedelsöötmesse ning neid kasvatati ja levaansukraaside ekspressioon algatati,
nagu on kirjeldatud eespool. Bakterikultuuri tsentrifuugiti 2400 g (5 min, 4°C) ja pesti kaks
korda 25 ml K-fosfaatpuhvriga (50 mM; pH 7.0). Rakud suspendeeriti 10 ml
sonikeerimispuhvris (10 mM imidasool, 50 mM NaH 2 PO 4 , 300 mM NaCl, 10% glütserool;
pH 6.0), külmutati 3x vedelas lämmastikus ning sulatati leiges vees, et suurendada valgu
17