Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Asp225Asn puhul aga puhastatud valke. Varem on meie töörühmas näidatud, et muteerimata<br />
<strong>Lsc3</strong> valgu TA on 76% (T. Visnapuu, avaldamata andmed). Antud töös tehtud katse näitas, et<br />
valgu <strong>Lsc3</strong> Asp62Ala mutandi TA on tunduvalt langenud – 37%-ni. Asp219Ala ja Glu303Ala<br />
mutantidel polnud TA muutunud ning sarnanes metsiktüüpi valguga. Siinkohal peab<br />
arvestama, et nendel mutantidel olid rakulüsaatides eriaktiivsused väga väikesed (vt. Tabel 3),<br />
mistõttu ei pruugi saadud tulemused olla tõepärased ning määramisi tuleks korrata puhastatud<br />
preparaatidega. Puhastatud <strong>Lsc3</strong> P222L, D225A ja D225N valkudel polümeriseerivas<br />
aktiivsuses olulisi erinevusi, võrreldes metsiktüüpi valguga, ei leitud. Kirjandusest võib leida<br />
andmeid, kus <strong>levaansukraasi</strong>de katalüütilise kolmiku aminohapete muteerimisel TA on jäänud<br />
samuti väga sarnaseks muteerimata algsele valgule, näiteks Z. mobilis’e LevU korral, kus<br />
stabiliseerija mutandil Asp194Asn oli TA samasugune nagu metsiktüüpi valgul (Yanase et<br />
al., 2002).<br />
Mutantsete <strong>levaansukraasi</strong>de reaktsiooniprodukte uurisime ka õhukese kihi kromatograafiaga<br />
(TLC) (Joonis 6). Reaktsioonisegud ja TLC tehti, nagu on näidatud eespool (pt. 2.2.5 ja<br />
2.2.8).<br />
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.<br />
Joonis 6. Mutantsete valkude polümerisatsiooniproduktide lahutamine õhukese kihi<br />
kromatograafiaga. Reaktsioonisegud sisaldasid 1.2 M sahharoosi. Rajad: 1. markerid: levaan<br />
(2%), kestoos PA 3 (25 mM) ja fruktoos (0.1 M); 2. Markerid: nüstoos PA 4 (25 mM) ja<br />
sahharoos (0.1 M); 3. <strong>Lsc3</strong> wt puhastatud valk; 4. <strong>Lsc3</strong> D62A; 5. <strong>Lsc3</strong> D219A; 6. <strong>Lsc3</strong><br />
E303A; 7. <strong>Lsc3</strong> D225A; 8. <strong>Lsc3</strong> D225N; 9. <strong>Lsc3</strong> P222L. F – fruktoos; S – sahharoos; K –<br />
kestoos; N – nüstoos; L – levaan.<br />
Õhukese kihi kromatograafiaga saadud tulemuste analüüs kinnitas, et <strong>Lsc3</strong> mutantsetel<br />
valkudel D62A, D219A ning E303A polümeriseeriv aktiivsus praktiliselt puudus: tekkinud oli<br />
väga vähe polümerisatsiooniprodukte. Kõige inaktiivsem tundus olevat D62A mutant, sest<br />
peale substraadina reaktsioonisegusse lisatud sahharoosi polnud muid komponente võimalik<br />
32
Change language