Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...

2. EKSPERIMENTAALOSA
2.1 Töö eesmärgid
1. Erinevate levaansukraaside valgujärjestuste joonduse alusel ennustada, millised
aminohapped võiksid kuuluda taimepatogeeni Pseudomonas syringae pv. tomato
DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilisse tsentrisse.
2. Muteerida koht-suunatult levaansukraasi Lsc3 aspartaat (Asp) positsioonis 62 ja
glutamaat (Glu) positsioonis 303 alaniiniks (Ala) ning kloneerida vastavate
mutatsioonidega lsc3 geenid pURI3 ekspressioonivektorisse, kus lisandub
sünteesitavatele valkudele N-terminaalne His 6 -järjestus.
3. Kloneerida pURI3 vektorisse mutantsed lsc3 geenid, kus aspartaadid (Asp)
positsioonis 219 või 225 olid muudetud alaniiniks (Ala) või asparagiiniks (Asn).
4. Ekspresseerida mutantseid levaansukraase (Lsc3 Asp62Ala; Asp219Ala;
Asp219Asn; Pro222Leu; Asp225Ala; Asp225Asn; Glu303Ala) Escherichia coli
tüves BL21(DE3) ja määrata mutantsete ensüümide funktsionaalsust ning omadusi,
et kindlaks teha, kas need aminohapped võiksid olla Lsc3 katalüüsis olulised.
2.2 Materjal ja metoodika
2.2.1 Kasutatud tüved ja plasmiidid
Konstruktide tegemiseks kasutati E. coli tüve DH5α (supE44 ΔlacU169 (φ80 lacZΔM15)
recA1 endA1 hsdR17 thi-1 gyrA96 relA1) (Invitrogen, CA, USA; Miller, 1972) ning
mutantseid valke ekspresseeriti E. coli tüves BL21(DE3) (hsdS gal (λcIts857 ind1 Sam7 nin5
lacUV5-T7 gene 1)) (Studier and Moffatt, 1986).
Töös kasutatud ja konstrueeritud plasmiidid on esitatud Tabelis 2.
Metsiktüüpi ja mutantsete levaansukraaside ekspresseerimiseks kasutasime pURI3 vektorit
(2737 ap) (Rivas et al., 2007), kuhu oli kloneeritud bakteri P. syringae pv. tomato DC3000
algne või mutantne levaansukraasi kodeeriv geen lsc3, ning saadi konstrukt pURI3-lsc3 (3820
ap). Kõigis pURI3 vektori konstruktides liitub ekspresseeritava Lsc3 valgu N-terminusse
His 6 - järjestus.
13