Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
Et katseliselt kinnitada Asp62 ja Glu303 kuuluvust katalüütilisse kolmikusse, muteeriti<br />
vastavad aspartaadi koodonid lsc3 geenis alaniini koodoniteks (vt. Tabel 2). Mutantsed lsc3<br />
geenid saadi nn. megapraimeri meetodiga (pt. 2.2.2), mis põhineb lsc3 geenilõigu<br />
paljundamisel mutatsiooni sisaldava praimeriga ning järjestuse edasisel pikendamisel (Wei et<br />
al., 2004; Tiirik, 2010). Mutatsiooni sisaldavad lsc3 geenid kloneeriti restriktaasi- ja<br />
ligeerimisvaba metoodikat kasutades vektorisse pURI3 (pt. 2.2.2; Geiser et al., 2001; Rivas et<br />
al., 2007). Selles vektoris geeni ekspresseerides liitub valgule N-terminaalne His 6 -järjestus,<br />
millega valk seondub Ni 2+ -agaroosile, ning võimaldab seega valgu lihtsat puhastamist E. coli<br />
transformandi rakuekstraktist. Konstrueerisime plasmiidid pURI3-lsc3D62A ning pURI3-<br />
lsc3E303A (Tabel 2, LISA 1).<br />
Meie töörühmas on eelnevalt valmistatud <strong>Lsc3</strong> mutandid Asp219Ala, Asp219Asn,<br />
Asp225Ala, Asp225Asn, millele vastavad geenid on kloneeritud Hansenula polymorpha<br />
maltaasi geeni promootori kontrolli alla vektorisse pHIPMalprom. Oletasime, et Asp219<br />
võiks olla <strong>Lsc3</strong> valgu katalüütiline aminohape (stabiliseerija). Samas mõjutab Asp225<br />
asendamine <strong>Lsc3</strong> valgus katalüütilist aktiivsust vähe ning ilmselt see aminohape katalüütilisse<br />
kolmikusse ei kuulu (Tiirik, 2010). Käesoleva töö raames kloneeriti eelpool nimetatud<br />
mutantsed lsc3 järjestused pURI3 vektorisse, et uurida puhastatud mutantsete valkude<br />
omadusi ja kinnitada nende aminohapete positsioonide eelneval uurimisel saadud tulemusi.<br />
Vastavat mutatsiooni sisaldav <strong>levaansukraasi</strong> geen amplifitseeriti sobivatest pHIPMalprom<br />
konstruktidest spetsiifiliste pikkade praimeritega (<strong>Lsc3</strong>pURI3Fw ja <strong>Lsc3</strong>pURI3Rev), mis<br />
tekitavad <strong>levaansukraasi</strong> geeni otstele pURI3 vektoriga komplementaarsed järjestused, ning<br />
geenid kloneeriti vektorisse pURI3. Saadi plasmiidid pURI3-lsc3D219A, pURI3-lsc3D219N,<br />
pURI3-lsc3D225A, pURI3-lsc3D225N (Tabel 2).<br />
Kuna meie töörühmas on <strong>levaansukraasi</strong> keemilise mutageneesi teel saadud raamatukogust<br />
isoleeritud juhuslik mutant Pro222Leu (Mardo, 2011), mille mutatsioon asub aktiivtsentri<br />
läheduses, siis puhastasime ka selle mutantse valgu ja uurisime tema omadusi.<br />
Saadud plasmiidid transformeeriti E. coli tüvesse DH5α ja transformandid plaaditi LB<br />
söötmetassidele, kuhu oli lisatud kolooniate selektsiooniks ampitsilliini (pt. 2.2.4).<br />
Kolooniatel kontrolliti lsc3 geeni olemasolu PCR-iga, eraldati plasmiidne DNA ning<br />
mutatsioonide asukohta kontrolliti lsc3 geeni järjestuse sekveneerimisega (pt. 2.2.3).<br />
24
Change language