Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
1.3.2 Fruktosüültransferaaside mutatsioonanalüüs<br />
Meng ja Fütterer (2003) muteerisid B. subtilis’e SacB kristallstruktuuri põhjal ennustatud<br />
aktiivtsentri aminohappeid (Tabel 1) alaniiniks ning määrasid mutantsetel valkudel levaani<br />
teket. Selgus, et mutandid (Asp86Ala, Asp247Ala, Glu342Ala) olid inaktiivsed ning levaani<br />
ei sünteesitud (Meng ja Fütterer, 2003).<br />
Martinez-Fleites et al. (2005) näitasid, et G. diazotrophicus’e LsdA Asp135 asendamisel<br />
asparagiiniga vähenes ensüümi katalüütiline konstant (k cat ) 2300 korda. Kui LsdA kohtsuunatud<br />
mutageneesil RDP-motiivis paiknev aspartaat 309 asendati asparagiiniga, alanes<br />
ensüümi võime sahharoosi hüdrolüüsida ja k cat vähenes ligi 75 korda. Samas ei toimunud<br />
muutusi ensüümi afiinsuses sahharoosile. Sellega tõestati, et Asp135 ja Asp309 on LsdA<br />
valgus vastavalt katalüütiline nukleofiil ja vaheühendi stabiliseerija (Tabel 1) (Batista et al.,<br />
1999; Martinez-Fleites et al., 2005).<br />
Analüüsides Z. mobilis’e <strong>levaansukraasi</strong> LevU juhuslikke ja koht-suunatud mutageneesiga<br />
saadud mutante leiti, et Glu278 asendamine aspartaadiga vähendas mutantse valgu<br />
katalüütilise konstandi väärtust ligi 30 korda, olgugi et üks negatiivne aminohape vahetati<br />
teise negatiivse laenguga aminohappe vastu. Kui Glu278 asendati positiivse laenguga<br />
histidiiniga, muutus k cat 210 korda väiksemaks, kuid nii mutansete ensüümide afiinsus (K m )<br />
sahharoosile kui ka transfruktosüleeriv ehk polümeriseeriv aktiivsus (TA) jäid peaaegu<br />
samaks. Yanase et al. (2002) järeldasid, et Glu278 on ilmselt alus-hape katalüüsija. Asp194<br />
muteerimisel asparagiiniks kaotas ensüüm peaaegu täielikult võime sahharoosi hüdrolüüsida –<br />
k cat vähenes ligi 3400 korda. Afiinsus sahharoosi suhtes tõusis 3 korda, kuid<br />
transfruktosüleerivas aktiivsuses muutusi polnud. Seega Asp194, mis paikneb kõrgelt<br />
konserveerunud RDP-motiivis, on samuti substraadi hüdrolüüsil oluline aminohape ning<br />
reakstiooni vaheühendi stabiliseerija (Tabel 1) (Yanase et al., 2002).<br />
Grampositiivsel piimhappebakteril L. reuteri’l on olemas nii inulosukraas (Inu) kui ka<br />
levaansukraas (Lev). Valkude järjestuste joondus B. subtilis’e SacB-ga näitas, et L. reuteri<br />
FTF-ide võimalikud katalüütilised aminohapped on Asp249, Asp404, Glu503 (Lev) ja<br />
Asp272, Asp424, Glu523 (Inu) (vt. ka Tabel 1) (Ozimek et al., 2004). Kinnitamaks nende ahte<br />
olulisust katalüüsis, muteeriti vastavad järjestused suunatult asparagiiniks või glutamiiniks<br />
ning määrati ensüümide koguaktiivsust, mõõtes sahharoosi hüdrolüüsil tekkivat glükoosi<br />
hulka. Mutantide katalüüsi aktiivsus, võrreldes muteerimata valguga, oli vähenenud vähemalt<br />
10000 korda. Määrati ka mutantide kineetilisi parameetreid ja leiti, et näiteks k cat sahharoosi<br />
suhtes mutantsel Lev valgul Asp404Asn oli langenud 613000 korda, samas afiinsus substraadi<br />
suhtes ei muutunud (Ozimek et al., 2004).<br />
11
Change language