Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
eristada. Valkude <strong>Lsc3</strong> D225A, D225N ja D225A sünteesitavate produktide spekter jäi aga<br />
sarnaseks <strong>Lsc3</strong> muteerimata valguga. Tekkinud oli nii nüstoosi, kestoosi kui ka<br />
polüsahhariidset levaani, mis ei liikunud kromatograafiaplaadi stardijoonelt.<br />
2.3.2.4 Valgu <strong>Lsc3</strong> katalüütilise kolmiku aminohapete identifitseerimine<br />
Mutantsete valkude analüüsil selgus, et suure tõenäosusega moodustavad <strong>Lsc3</strong> valgu<br />
katalüütilise kolmiku Asp62, Asp219 ja Glu303, mis võiksid olla vastavalt nukleofiiliks,<br />
vahekompleksi stabiliseerijaks ja alus-hape katalüüsijaks. Rakulüsaatidest mõõdetud<br />
<strong>levaansukraasi</strong> koguaktiivsused näitasid, et mutantsetel valkudel D62A, D219A ja E303A<br />
puudus katlüütiline aktiivsus peaaegu täielikult (Tabel 3). Ka teiste bakterite <strong>levaansukraasi</strong>de<br />
muteerimisega on näidatud, et katalüütilise tsentri aminohapete muteerimisel langeb<br />
katalüütiline efektiivsus väga tugevasti. Näiteks Z. mobilis’e <strong>levaansukraasi</strong> LevU alus-hape<br />
katalüüsija mutantidel Glu278Asp ja Glu278His langes ensüümi katalüütiline efektiivsus<br />
langes vastavalt ~40 ja ~450 korda. Kui aga fruktosüül-ensüümi vaheühendi stabiliseerija<br />
Asp194 muudeti asparagiiniks, siis LevU katalüütiline efektiivsus langes veel palju rohkem –<br />
8340 korda (Yanase et al., 2002).<br />
Puhastatud <strong>Lsc3</strong> mutandil Pro222Leu ei olnud substraadispetsiifikas ega afiinsuse<br />
parameetrites suuri muutusi, võrreldes metsiktüüpi valguga, kuid katalüütiline aktiivsus oli<br />
mõnevõrra langenud. <strong>Lsc3</strong> valgu mutant Asp225Ala käitus nagu muteerimata <strong>Lsc3</strong>. Mutandil<br />
Asp225Asn oli paranenud rafinoosi kasutamise. Aminohapete Asp225 ja Pro222 mutantidel<br />
ei muutunud sahharoosist sünteesitavate polümerisatsiooniproduktide muster. Saadud<br />
andmete põhjal võib järeldada, et Asp225 ning Pro222 katalüütilise tsentri aminohapete hulka<br />
ei kuulu ja katalüüsis eriti olulised ei ole.<br />
33
Change language