Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...

SISUKORD
SISUKORD ...................................................................................................................................... 2
KASUTATUD LÜHENDID ............................................................................................................ 3
SISSEJUHATUS .............................................................................................................................. 4
1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE ....................................................................................................... 5
1.1 Glükosiidi hüdrolaasid ............................................................................................................ 5
1.2 Glükosiidi hüdrolaaside perekondadesse 32 ja 68 kuuluvate valkude omadused ja ehitus .... 5
1.3 Fruktosüültransferaaside ehitus ja aktiivtsenter...................................................................... 7
1.3.1 Fruktosüültransferaaside katalüütilised aminohapped ja kristallstruktuurid ................... 7
1.3.2 Fruktosüültransferaaside mutatsioonianalüüs ................................................................ 11
2. EKSPERIMENTAALOSA ........................................................................................................ 13
2.1 Töö eesmärgid ...................................................................................................................... 13
2.2 Materjal ja metoodika ........................................................................................................... 13
2.2.1 Kasutatud tüved ja plasmiidid ........................................................................................ 13
2.2.2 Levaansukraasi geeni suunatud muteerimine ja kloneerimine pURI3 vektorisse ......... 14
2.2.3 Elektroporatsioon, kolooniate kontrollimine, DNA eraldamine ja sekveneerimine ...... 16
2.2.4 Transformantide kasvatus, levaansukraaside ekspresseerimine ja rakuekstraktide
tegemine .................................................................................................................................. 17
2.2.5 Levaansukraasi aktiivsuse määramine ........................................................................... 18
2.2.6 Mutantsete levaansukraaside puhastamine Ni +2 -afiinsuskromatograafiaga .................. 19
2.2.7 Geelelektroforees ........................................................................................................... 20
2.2.8. Õhukese kihi kromatograafia ........................................................................................ 21
2.3 Tulemused ja arutelu ............................................................................................................ 21
2.3.1 Levaansukraasi Lsc3 võimalike katalüütiliste aminohapete ennustamine ja vastavate
mutantide konstrueerimine ..................................................................................................... 21
2.3.2 Levaansukraasi mutantide iseloomustamine ja katalüütilise kolmiku aminohapete
identifitseerimine .................................................................................................................... 25
2.3.2.1 Mutantsete levaansukraaside ekspresseerimine, transformantide fenotüübi uurimine
ning levaansukraasi koguaktiivsused rakuekstraktides ........................................................... 25
2.3.2.2 Mutantsete valkude puhastamine ja nende kineetilised parameetrid .......................... 29
2.3.2.3 Mutantsete Lsc3 valkude polümerisatsiooniproduktid ............................................... 31
2.3.2.4 Valgu Lsc3 katalüütilise kolmiku aminohapete identifitseerimine ............................ 33
KOKKUVÕTE ............................................................................................................................... 34
SUMMARY ................................................................................................................................... 35
KASUTATUD KIRJANDUS ........................................................................................................ 36
KASUTATUD VEEBIAADRESSID ............................................................................................ 39
LISA 1
LISA 2
LISA 3
2