Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalÃ¼Ã¼tilise ...

More documents

Recommendations

Info

Tabel 2. Kasutatud plasmiidid, nende päritolu, koodonite ja vastavate aminohapete vahetused ning mutatsioonide asukohad valgus. Alla on joonitud vastavas koodonis muteeritud nukleotiidid. Plasmiid pHIPMalprom-lsc3D219A pHIPMalprom-lsc3D219N pHIPMalprom-lsc3D225A pHIPMalprom-lsc3D225N pURI3 (ekspressioonivektor) pURI3-lsc3 (sisaldab muteerimata lsc3-e) pURI3-lsc3D62A pURI3-lsc3D219A pURI3-lsc3D219N pURI3-lsc3P222L pURI3-lsc3D225A pURI3-lsc3D225N pURI3-lsc3E303A Koodoni ja aminohappe vahetus GAC→GCC; Asp→Ala GAC→AAC; Asp→Asn GAT→GCC; Asp→Ala GAT→AAT; Asp→Asn Mutatsiooni asukoht valgus Viide 219 Tiirik, 2010 219 Tiirik, 2010 225 Tiirik, 2010 225 Tiirik, 2010 - - Rivas et al., 2007 - - GAC→GCC; Asp→Ala GAC→GCC; Asp→Ala GAC→AAC; Asp→Asn CCG→CTG; Pro→Leu GAT→GCC; Asp→Ala GAT→AAT; Asp→Asn GAG→GCG; Glu→Ala 62 T. Visnapuu, avaldamata andmed käesolev töö; LISA 1 219 käesolev töö 219 käesolev töö 222 K. Mardo, avaldamata andmed 225 käesolev töö 225 käesolev töö 303 käesolev töö; LISA 1 2.2.2 Levaansukraasi geeni suunatud muteerimine ja kloneerimine pURI3 vektorisse Mutatsioonide Asp62Ala ja Glu303Ala koht-suunatult lsc3 geeni viimiseks kasutati PCR-i (Polymerase Chain Reaction) põhist megapraimeri meetodit (Wei et al., 2004; Tiirik, 2010). Kõik muteerimiseks vajalikud amplifikatsioonietapid tehti Fermentase (Leedu) Pfu DNA polümeraasiga. Restriktsiooniks kasutati sama firma restriktaase ning tootjapoolset standardprotokolli. Pikk praimer (megapraimer) sünteesiti PCR-i reaktsioonisegus, mis sisaldas 1x Pfu puhvrit (Fermentas), 0.2 mM dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP; Fermentas), 4 mM MgSO 4, kumbagi praimerit 0.5 pmol, 0.025 U/μl Pfu DNA polümeraasi. Matriitsina kasutati muteerimata levaansukraasi geeni sisaldavat plasmiidi pURI3-lsc3. Praimeriteks olid 14
vastavalt kas päripraimer T7 (5’ TAATACGACTCACTATAGGG 3’) ja vastupraimer D62ARev (5’ CATGGTGGCCCAGATGAAT 3’) või päripraimer E303AFw (5’ TGATCAGACCGCGCGCC 3’) ja vastupraimer Ampsaba (5’ CTGAGATAGGTGCCTCAC 3’). Muteerimispraimerid D62ARev ja E303AFw sisaldavad selliseid lämmastikaluse vahetusi (praimeri järjestuses alla joonitud), et Asp62 ja Glu303 asendatakse koodoni muutuse kaudu alaniiniga (vt. Tabel 2). PCR-i produktid (megapraimerid) lahutati elektroforeesiga (vt. pt. 2.2.7). Vastavalt 320 ap ja 555 ap pikkused DNA fragmendid lõigati geelist välja ning puhastati Mo Bio (USA) Ultra Clean TM 15 DNA puhastamise komplektiga tootjapoolse protokolli järgi. Seejärel tehti megapraimerite pikendamiseks uus PCR. Reaktsioonisegu sisaldas vastavat megapraimerit, matriits-DNA-d (pURI3-lsc3), 1x Pfu puhvrit, 0.04 mM dNTP, 4 mM MgSO 4, 0.05 U/μl Pfu DNA polümeraasi ning programm oli järgmine: 1. DNA ahelate denatureerimine 96°C 2 minutit; 2. Megapraimeri paardumine DNA ahelaga 60°C 2 minutit; 3. DNA süntees 72°C 5 minutit; Tsüklite arv: 10. Proove inkubeeriti restriktaasiga DpnI (lõppkonts. 0.2 U/µl) 90 min 37°C, et lagundada segus algne metüleeritud matriits-DNA. Mutatsiooni sisaldav lsc3 fragment (1369 ap) paljundati segust praimeritepaariga Lsc3pURI3Fw (5’ CATCATGGTGACGATGACGATAAGATGTACAATAGCAACTCTGCTGTAA 3’) ja Lsc3pURI3Rev (5’ AAGCTTAGTTAGCTATTATGCGTAGTTCTTCAGGTATGGGAACGGCGTG 3’). Kaldkirjas on pURI3 vektoriga komplementaarne järjestus ning ülejäänud osa praimerist seondub lsc3 geeni otstele. Produkti olemasolu kontrolliti 1% agaroosgeelil ning puhastati geelist Mo Bio Ultra Clean TM 15 komplektiga. Mutatsiooni sisaldava lsc3 geeni liitmiseks pURI3 vektorisse kasutasime restriktaasi- ja ligeerimisvaba PCR-i põhist kloneerimist (Geiser et al., 2001; Rivas et al., 2007). pURI3 vektoriga komplementaarsete otstega lsc3 geen paljundati plasmiididelt pHIPMalpromlsc3D219A, pHIPMalprom-lsc3D219N, pHIPMalprom-lsc3D225A, pHIPMalpromlsc3D225N praimeritega Lsc3pURI3Fw ja Lsc3pURI3Rev või saadi suunatud muteerimisega, nagu on kirjeldatud eespool. Saadud mutantsed lsc3 fragmendid lahutati agaroosgeelis, puhastati ja tehti ekstensioonietapp, kus lsc3 geen kloneerub pURI3 vektorisse. Reaktsioonisegu sisaldas puhastatud lsc3 fragmenti, vektorit pURI3, 0.1 mM dNTP, 1x Pfu puhvrit, 4 mM MgSO 4 , 0.05 U/μl Pfu DNA polümeraasi ning programm oli järgmine: 1. DNA ahelate denatureerimine 95°C 1 minut; 15
Page 1 and 2: TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOG
Page 3 and 4: KASUTATUD LÜHENDID ah - aminohape
Page 5 and 6: 1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 1.1 Glükos
Page 7 and 8: varieeruv piirkond, konserveerunud
Page 9 and 10: B. subtilis’e levaansukraas SacB
Page 11 and 12: 1.3.2 Fruktosüültransferaaside mu
Page 13: 2. EKSPERIMENTAALOSA 2.1 Töö eesm
Page 17 and 18: lõik. Levaansukraasi geeni teise p
Page 19 and 20: sahharoosi (puhastatud valkude puhu
Page 21 and 22: Denatureeriv polüakrüülamiidgeel
Page 23 and 24: 80 90 100 110 120 130 140 ....|....
Page 25 and 26: 2.3.2 Levaansukraasi mutantide isel
Page 27 and 28: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Page 29 and 30: Tabel 4. Levaansukraaside 100 mM sa
Page 31 and 32: substraadiks oli rafinoos. Afiinsus
Page 33 and 34: eristada. Valkude Lsc3 D225A, D225N
Page 35 and 36: Identification of catalytic triad a
Page 37 and 38: the plant phatogens Pseudomonas syr
Page 39 and 40: Visnapuu, T. (2007). Levaansukraasi
Page 41 and 42: LISA 2 Ni +2 -afiinsuskromatograafi

Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalÃ¼Ã¼tilise ...

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?