Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalÃ¼Ã¼tilise ...

More documents

Recommendations

Info

Hallitusseene A. japonicus’e FTF-i AjFT aktiivtsentri moodustavad Asp60, Asp191 ja Glu292 (Tabel 1). Need aminohapped katalüüsivad fruktosüüli ülekannet ning seovad fruktoosijäägi - 1 alapiirkonda. Need aminohapped muteeriti suunatult alaniiniks ning näidati, et mutantsed ensüümid kaotasid peaaegu täielikult oma aktiivsuse (Chuankhayan et al., 2010). 12
2. EKSPERIMENTAALOSA 2.1 Töö eesmärgid 1. Erinevate levaansukraaside valgujärjestuste joonduse alusel ennustada, millised aminohapped võiksid kuuluda taimepatogeeni Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilisse tsentrisse. 2. Muteerida koht-suunatult levaansukraasi Lsc3 aspartaat (Asp) positsioonis 62 ja glutamaat (Glu) positsioonis 303 alaniiniks (Ala) ning kloneerida vastavate mutatsioonidega lsc3 geenid pURI3 ekspressioonivektorisse, kus lisandub sünteesitavatele valkudele N-terminaalne His 6 -järjestus. 3. Kloneerida pURI3 vektorisse mutantsed lsc3 geenid, kus aspartaadid (Asp) positsioonis 219 või 225 olid muudetud alaniiniks (Ala) või asparagiiniks (Asn). 4. Ekspresseerida mutantseid levaansukraase (Lsc3 Asp62Ala; Asp219Ala; Asp219Asn; Pro222Leu; Asp225Ala; Asp225Asn; Glu303Ala) Escherichia coli tüves BL21(DE3) ja määrata mutantsete ensüümide funktsionaalsust ning omadusi, et kindlaks teha, kas need aminohapped võiksid olla Lsc3 katalüüsis olulised. 2.2 Materjal ja metoodika 2.2.1 Kasutatud tüved ja plasmiidid Konstruktide tegemiseks kasutati E. coli tüve DH5α (supE44 ΔlacU169 (φ80 lacZΔM15) recA1 endA1 hsdR17 thi-1 gyrA96 relA1) (Invitrogen, CA, USA; Miller, 1972) ning mutantseid valke ekspresseeriti E. coli tüves BL21(DE3) (hsdS gal (λcIts857 ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7 gene 1)) (Studier and Moffatt, 1986). Töös kasutatud ja konstrueeritud plasmiidid on esitatud Tabelis 2. Metsiktüüpi ja mutantsete levaansukraaside ekspresseerimiseks kasutasime pURI3 vektorit (2737 ap) (Rivas et al., 2007), kuhu oli kloneeritud bakteri P. syringae pv. tomato DC3000 algne või mutantne levaansukraasi kodeeriv geen lsc3, ning saadi konstrukt pURI3-lsc3 (3820 ap). Kõigis pURI3 vektori konstruktides liitub ekspresseeritava Lsc3 valgu N-terminusse His 6 - järjestus. 13
Page 1 and 2: TARTU ÜLIKOOL LOODUS- JA TEHNOLOOG
Page 3 and 4: KASUTATUD LÜHENDID ah - aminohape
Page 5 and 6: 1. KIRJANDUSE ÜLEVAADE 1.1 Glükos
Page 7 and 8: varieeruv piirkond, konserveerunud
Page 9 and 10: B. subtilis’e levaansukraas SacB
Page 11: 1.3.2 Fruktosüültransferaaside mu
Page 15 and 16: vastavalt kas päripraimer T7 (5’
Page 17 and 18: lõik. Levaansukraasi geeni teise p
Page 19 and 20: sahharoosi (puhastatud valkude puhu
Page 21 and 22: Denatureeriv polüakrüülamiidgeel
Page 23 and 24: 80 90 100 110 120 130 140 ....|....
Page 25 and 26: 2.3.2 Levaansukraasi mutantide isel
Page 27 and 28: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 1. 2. 3. 4. 5. 6.
Page 29 and 30: Tabel 4. Levaansukraaside 100 mM sa
Page 31 and 32: substraadiks oli rafinoos. Afiinsus
Page 33 and 34: eristada. Valkude Lsc3 D225A, D225N
Page 35 and 36: Identification of catalytic triad a
Page 37 and 38: the plant phatogens Pseudomonas syr
Page 39 and 40: Visnapuu, T. (2007). Levaansukraasi
Page 41 and 42: LISA 2 Ni +2 -afiinsuskromatograafi

Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalÃ¼Ã¼tilise ...

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?