Pseudomonas syringae DC3000 levaansukraasi Lsc3 katalüütilise ...

substraadiks oli rafinoos. Afiinsus rafinoosile oli paranenud. Kuigi eespool kirjeldatud
sahharoosi ja rafinoosi hüdrolüüsiva aktiivsuse võrdlemisel tundus, et valgu Asp225Asn
substraadispetsiifikas muutusi ei ole toimunud (Tabel 6), näitas kineetika uurimine
Asp225Asn valgul selgesti afiinsuse tõusu rafinoosile.
Seejärel arvutasime valkude katalüütilised konstandid ning katalüütilise efektiivsuse.
Katalüütiline konstant k cat (1/min) arvutati võttes arvesse vastava valgu V max väärtust ja
ensüümi molekulmassi ning katalüütiline efektiivsus (1/M*min) leiti k cat ja K m jagatise kaudu.
Katalüütiline konstant vastab maksimaalsele substraadi molekulide arvule, mille reageerimist
on üks ensüümimolekul (aktiivtsenter) ajaühikus võimeline katalüüsima. Tulemused on
toodud Tabelis 7.
Tabel 7. Puhastatud levaansukraaside katalüütilised konstandid (k cat ; 1/min) ja katalüütilised
efektiivused (k cat /K m ; 1/M*min) nii sahharoosiga kui ka rafinoosiga. Toodud on ka
muteerimata valgu vastavad parameetrid.
SAHHAROOS
RAFINOOS
Valk
k
k cat (1/min)
cat /K m k cat (1/min) k cat /K m
(1/M*min)
(1/M*min)
Lsc3 wt* 3.03 x 10 4 164.0 x 10 4 1.10 x 10 4 24.5 x 10 4
Lsc3 P222L 2.25 x 10 4 84.4 x 10 4 0.79 x 10 4 26.6 x 10 4
Lsc3 D225A 2.92 x 10 4 111.0 x 10 4 1.02 x 10 4 34.9 x 10 4
Lsc3 D225N 4.11 x 10 4 149.0 x 10 4 1.23 x 10 4 54.1 x 10 4
* Võrdluseks toodud puhastatud muteerimata Lsc3 valgu andmed on saadud T. Visnapuult.
Nägime, et Lsc3 mutandi Pro222Leu katalüütiline efektiivsus sahharoosiga langes ~2 korda.
Valkudel Asp225Ala ja Asp225Asn polnud olulist katalüütilise efektiivsuse langust märgata
(vastavad näitajad langesid metsiktüüpi valguga võrreldes ~1.5 ja ~1.1 korda). Kui
substraadiks oli rafinoos, siis katalüütiline efektiivsus oli valkudel Asp225Ala ja Asp225Asn
veidi tõusnud.
2.3.2.3 Mutantsete Lsc3 valkude polümerisatsiooniproduktid
Selleks, et uurida, kas mutantsete levaansukraaside polümeriseerivas ehk
transfruktosüleerivas aktiivsuses on toimunud muutusi, määrati ensümaatilisel meetodil
reaktsioonisegus tekkinud vaba glükoosi ja fruktoosi hulka (pt. 2.2.5). Levaansukraasi TA
väljendati protsendina, mis näitab polümeriseeritud fruktoosi osakaalu reageerinud
sahharoosis sisaldunud fruktoosist. Võimalike katalüütilise tsentri aminohapete mutantide
puhul kasutati ensüümpreparaadina rakulüsaate, mutantide Pro222Leu, Asp225Ala ning
31