Aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule

Material und Methoden 37
10. Spülen der Schnitte für 15 Min. mit 1 x PBS + 5 mM MgCl2 (frisch
herstellen);
11. Azetylierung in 0,25%igem Azetanhydrid in 0,1 M Triethanolamin, pH 7,5, für
10 Min. (frisch herstellen);
12. Spülen der Schnitte, zweimal für 1 Min. und anschließend für 15 Min. in
1 x PBS;
13. Prähybridisierung für mindestens 60 Min. bei 37°C im
Prähybridisierungspuffer (unter Verwendung einer eingefrorenen
Stammlösung frisch herstellen);
14. Hybridisierungspuffer herstellen (unter Verwendung einer eingefrorenen
Stammlösung, frisch) mit bzw. ohne den Zusatz der spezifischen Sonde und
Überschichten der Schnitte mit 35 µl; mit Gel-bond®-Film (Fa. FMCR®
bioproducts, Göttingen) abdecken und mit Fix-O-Gum® (Fa. Marabuwerke
GmbH & Co KG, Tamm) gut abdichten;
15. Denaturieren für 10 Min. waagrecht auf einer Heizplatte mit 95°C;
16. Hybridisierung für 16 Stunden bei 37°C im Wärmeschrank und feuchter
Kammer;
17. Posthybridisierungswaschung (nach Abheben des Gel-bond®-Films und des
Fix-O-Gum® mit einer Pinzette) zweimal für 15 Min. bei 42°C mit
6 x SSC+45%iges Formamid (frisch herstellen);
18. Spülen der Schnitte, zweimal für 5 Min. mit 2 x SSC;
19. Spülen der Schnitte, zweimal für 15 Min. mit 0,2 x SSC bei 42°C;
20. Spülen der Schnitte, für 1 Min. mit Puffer 1;
21. Inkubation für 30 Min. mit Block-Lösung (Puffer 2, frisch herstellen);
22. Inkubation der Schnitte für 2 Stunden mit Anti-DIG-Antikörper (Fa. Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim; alkalische Phosphatase-konjugiert) 1:200
verdünnt in Antikörperpuffer (frisch herstellen);
23. Spülen der Schnitte, zweimal für 15 Min. mit Puffer 1;
24. Spülen der Schnitte, zweimal für 5 Min. mit Puffer 3;
25. Inkubation der Schnitte mit der Färbelösung (s. Abschnitt 3.5.6) für ca.
16 Stunden im Dunkeln (Färbelösung frisch herstellen aus Stammlösung);