Aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule

74 Diskussion
gekoppelten Antikörpers gegen Digoxigenin an wirtseigenes Gewebe vermieden
werden können (HERRINGTON et al. 1989).
Die Methode der ISH für M. bovis-DNA wurde mittels einer DIG-markierter DNA-
Sonde etabliert. Um während der Etablierung sicher zu stellen, dass die einzelnen
Arbeitsschritte korrekt getätigt wurden, wurde zu Beginn eine ISH für porzines
Circovirus Typ 2 (PCV-2) mit positiver und negativer Kontrolle parallel durchgeführt.
Diese wurde im Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover
entwickelt (KRÜGER 2005). Die Sonden VspAI und VspAII wurden zunächst an
unverändertem Lungengewebe getestet, welches mit einer konzentrierten M. bovis-
Suspension injiziert worden war. Als negative Kontrolle dienten zum einen gleich
behandelte, allerdings nicht mit Sonde inkubierte Schnitte (nicht mit Sonde versetzter
Hybridisierungspuffer), sowie Lungengewebe, welches nur mit dem
Suspensionsmedium (ohne M. bovis) injiziert wurde. Nach Optimierung der einzelnen
Arbeitsschritte und Prozeduren erfolgte die Untersuchung der 35 Kälber mit dem in
Kapitel 3.5.8 aufgeführten Protokoll. Eine Entstehung des durch alkalische
Phosphatase katalysierten farbigen Niederschlags durch endogene Peroxidasen
wurde mittels Hemmung derselbigen durch Wasserstoffperoxid getestet. Zudem
wiesen die ohne Sonde inkubierten Schnitte keine Signale auf, so dass in diesen
Kontrollen die inaktive endogene Peroxidase regelmäßig mitgetestet wurde.
5.3 Ergebnisse der in situ-Hybridisierung
Bei den untersuchten Kälbern konnte mittels der ISH mit den Sonden VspAI und
VspAII M. bovis-DNA in den Nekrosen und im Exsudat bei katarrhalisch-eitrigen
Bronchopneumonien nachgewiesen werden. Es konnten hinsichtlich Lokalisation und
Verbreitung von M. bovis-DNA keine Unterschiede zwischen den beiden Sonden
festgestellt werden. Mit dem hier vorgelegten Protokoll sind somit beide Sonden in
der Lage, in das Zielgewebe einzudringen und mit M. bovis-DNA zu hybridisieren.
Demzufolge besitzen der M. bovis-Stamm 1067 und der französische Feldstamm, die
zur Infektion der Kälber aus Gruppe 3 und 4 verwendet wurden, ein vspA-Gen
(detektierbar mit der Sonde VspAI) sowie auch die vorgeschaltete Sequenz, die zum
Anschalten und damit zur Expression des VspA-Proteins notwendig ist (detektierbar
mit der Sonde VspAII). Die Sonden wurden anhand der Sequenz des M. bovis-