Aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule

40 Material und Methoden
4. Demaskierung: Proteolytische Vorbehandlung in 0,05%iger Protease XIV-
Lösung in vorgewärmter 1 x PBS (Protease XIV, Fa. Merck KGaA,
Darmstadt) mit 0,02% CaCl2, pH 7,4;
5. dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS für je 5 Min.;
6. Verbringen der Schnitte in Coverplates TM und Sequenza ® -Einsätze (Thermo
Electron GmbH, Dreieich);
7. Überschichten mit 1:5 verdünntem inaktiviertem Ziegen-Normalserum
(normal goat serum, NGS) in 1 x PBS für 20 Min.;
8. Auftragen des Primärantikörpers Maus-anti-Mycolasma bovis monoklonaler
Antikörper MAB970 (Fa. Chemicon international, Temecula, USA) verdünnt
1:1000 in 1 x PBS mit 1%igem bovinem Serumalbumin (BSA) und
Inkubation der Schnitte für 16 Stunden bei 4°C im Kühlschrank;
9. dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS mit 0,05% Tween 20 für je
5 Min.;
10. Auftragen des Sekundärantikörpers biotiniliertes Ziege-anti-Maus-Serum
(GAM-b, BA-9200, Fa. Vector, Burlingame, USA) 1:200 verdünnt in 1 x PBS
und Inkubation für 30 Min.;
11. dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS mit 0,05% Tween 20 für je
5 Min., anschließend noch einmal in reinem 1 x PBS für 5 Min.;
12. Inkubation der Schnitte mit dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex
Vectastain Elite ABC Kit (PK-6100, Fa. Vector, Burlingame, USA) für 30 Min.
bei Raumtemperatur (Herstellung des ABC-Komplexes mindestens 30 Min.
vor Gebrauch);
13. dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS für je 5 Min.;
14. Inkubation der Schnitte mit 0,05% 3,3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
(DAB) in 1 x PBS, pH 7,2, mit Zusatz von 3%iger H2O2-Lösung
(Endkonzentration 0,03%) für 5 Min. auf dem Magnetrührer bei
Raumtemperatur;
15. dreimaliges Waschen der Schnitte in 1 x PBS für je 5 Min.;
16. Spülen der Schnitte unter fließendem Leitungswasser;