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2) Der Mikroskopierende ist zunächst geneigt, wegen der übereinstimmenden Brechzahlen von Objektiv-Frontlinse, Immersionsflüssigkeit und Deckglas, keinen Unterschied zwischen Deckglasdickenkorrigierten (z. B. HI 100x/1,40 ∞/0,17) und Deckglasdickennichtkorrigierten (z. B. HI 100x/1,40 ∞/0) Immersionsobjektiven zu machen. Im monochromatischen Licht (Schwerpunktwellenlänge) kann er das sicher tun; im polychromatischen Licht weisen aber Immersionsflüssigkeit und Deckglas im Allgemeinen unterschiedliche Dispersionen auf, d. h., die Brechzahlen sind mehr oder weniger stark wellenlängenabhängig. Dieser Effekt macht sich im mikroskopischen Bild durch Farbfehler und sphärische Aberration bemerkbar. Also: man achte sorgfältig auf den Korrektionszustand des Objektives! zur Brechzahlbestimmung an isolierten Festkörpern angewendet wird. Dabei wird das zu vermessende Objekt in eine Immersionsflüssigkeit eingebettet, deren Brechzahl ungefähr in der Nähe der des Objektes liegt. Mittels eines Heiz- und Kühltisches wird nun die Temperatur so lange variiert, bis die Brechzahl der Flüssigkeit mit der des Objektes übereinstimmt. Wesentlich ist dabei die aus der Dulong-Petitschen Regel abgeleitete Tatsache, dass die Temperaturabhängigkeit der Brechzahl von Festkörpern signifikant geringer ist als die von Flüssigkeiten. Die Brechzahlbestimmung kann entweder mit Hilfe der „Beckeschen Linie” oder, wenn hohe Genauigkeiten erforderlich sind, mit interferometrischen Mitteln erfolgen; an dieser Stelle sei dazu auf die einschlägige Literatur verwiesen. Die förderliche Vergrößerung Damit das menschliche Auge zwei Bildpunkte (Bild 4) auch als solche sehen kann, muss – nach Ernst Abbe – zwischen ihnen ein Winkelabstand 2 zwischen 2 und 4 Bogenminuten, bzw. (7) 5,8 · 10 -4 ≤ 2 ≤ 11,6 · 10 -4 vorliegen. Die untere Grenze der Gesamtvergrößerung des Mikroskopes sei V u ; die obere Grenze V o , wobei die Gesamtvergrößerung des Mikroskopes V M gleich dem Quotienten aus der deutlichen Sehweite von 250 mm und der Gesamtbrennweite des Mikroskopes f M ist. Daraus lassen sich nun leicht V u und V o berechnen: (8a) 2∆y = 2∆y [mm] V u = 5,8 · 10 -4 (= 2’) f M 250 (8b) 2∆y = 2∆y [mm] V o = 11,6 · 10 -4 (= 4’) f M 250 Mit = 550 nm = 5,5 · 10 -4 mm und 2∆y min = = 2 sin 2 nA Obj erhält man schließlich (9a) V u · 5,5 · 10 -4 [mm] = 5,8 · 10 -4 500 · nA Obj und (9b) V o · 5,5 · 10 -4 [mm] = 11,6 · 10 -4 500 · nA Obj bzw. (9c) V u ≈ 500 nA Obj und (9d) V o ≈ 1000 nA Obj Die Leistungsfähigkeit des Mikroskopes wird also nur dann sinnvoll ausgenutzt, wenn seine Gesamtvergrößerung nicht kleiner als das 500fache und nicht größer als das 1000fache der numerischen Apertur des Arbeitsobjektives gewählt wird. Vergrößerungen > 1000 nA Obj bezeichneten unsere Altvorderen sehr trefflich als „leere Vergrößerungen”, weil eine Auflösung noch kleinerer Objektdetails nicht mehr erwartet werden kann, die Vergrößerung also ins „Leere“ geht. Rainer Danz, Carl Zeiss AG, Werk Göttingen danz@zeiss.de 14 Innovation 15, Carl Zeiss AG, 2005
Numerische Apertur Die numerische Apertur ist ein Hinweis auf das Auflösungsvermögen eines Objektivs. Vereinfacht ausgedrückt ist das Auflösungsvermögen eines Objektivs davon abhängig, wieviel Licht von einer Struktur des Präparates in das Objektiv gelangt. Diese Lichtmenge ist abhängig vom sogenannten Öffnungswinkel des Objektivs. Je größer der Öffnungswinkel ist, desto besser löst ein Objektiv die Details eines Präparates auf. Allerdings wird auf dem Objektiv nicht dieser Öffnungswinkel sondern die numerische Apertur angegeben. Definiert wird die numerische Apertur durch die Formel A = n * sin (A: numerische Apertur, n: Brechzahl des Mediums zwischen Deckglas und Frontlinse des Objektivs, sin : halber Öffnungswinkel des Objektivs. Frontlinse des Objektivs Aus der Formel für die numerische Apertur geht hervor, dass neben dem Öffnungswinkel des Objektivs auch die Brechzahl des Mediums zwischen Deckglas und Objektiv in die Berechnung eingeht. Bei den sogenannten Trockenobjektiven werden die Lichtstrahlen beim Eintritt in die Luft zwischen Deckglas und Objektiv gemäß des Brechungsgesetzes vom Lot weggebrochen. Stärker geneigte Lichtstrahlen gelangen somit nicht mehr in das Objektiv und tragen nicht zur Auflösung bei. Bei den Ölimmersionsobjektiven befindet sich zwischen Deckglas und Objektiv ein Immersionsöl: auch stärker geneigte Lichtstrahlen gelangen noch in das Objektiv. Frontlinse des Objektivs details Auflösungsvermögen Unter dem Auflösungsvermögen eines Objektivs versteht man das Vermögen, im mikroskopischen Bild zwei Objektdetails des Präparates getrennt abbilden zu können. Die numerische Apertur des Objektivs bestimmt direkt das Auflösungsvermögen; je größer die numerische Apertur, desto besser das Auflösungsvermögen. Die theoretisch erreichbare Auflösung beträgt in der Lichtmikroskopie etwa 0,20 µm. Definiert wird das Auflösungsvermögen eines Objektivs über die Formel d = 2 x A d: Abstand zwischen zwei Punkten, : Wellenlänge des Lichts, A: numerische Apertur des Objektivs Luft Trockenobjektiv Immersionsöl Deckglas Ölimmersionsobjektiv Brechzahl diverser Medien Brechzahl n der Medien durch die der Lichtstrahl im Strahlengang eines Mikroskops geht. Objektiv mit kleinem Öffnungswinkel Objektiv mit großem Öffnungswinkel Luft n = 1,000 Glas n = 1,513 Öl n = 1,516 Objektebene 2 2 Innovation 15, Carl Zeiss AG, 2005 15
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