pep-2 - Lehrstuhl für Ernährungsphysiologie - TUM

werden die 6 ml Wurm-Bleach-Gemisch auf vier 1,5 ml Eppendorfgefäße aufgeteilt und
für 2 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und wieder auf 1,5 ml
mit M9-Puffer aufgefüllt und erneut zentrifugiert. Nachdem der Überstand abgenommen
wurde, wird der Inhalt der vier Eppendorfgefäße auf nur noch zwei vereinigt.
Anschließend wird mit M9-Puffer wieder auf 1,5 ml aufgefüllt und zentrifugiert. Nun
folgen 5-10 Waschschritte mit M9-Puffer, bis kaum noch Chlorgeruch wahrgenommen
werden kann. Nach dem letzten Waschschritt wird der Inhalt der beiden Eppendorfgefäße
in ein 15 ml Falkon überführt, wobei jedes Eppendorfgefäß 3x mit M9 nachgespült wird.
Damit den Würmern ausreichend Sauerstoff zur Verfügung steht, wird mit M9-Puffer auf
etwa 6-8 ml aufgefüllt. Je nach Wurmmenge kann es auch sein, dass man die
Wurmsuspension auf mehrere Falkons aufteilen muss. Unter dem Mikroskop sollten Eier
erkennbar sein. Damit daraus L1 Larven schlüpfen können, lässt man das Falkon
anschließend über Nacht bei 15 °C rotieren. Solange kein Futter vorhanden ist, entwickeln
sich die L1 Larven nicht weiter.
Am folgenden Tag werden die Larven 1-2 mal mit M9-Puffer gewaschen. Um
Zelltrümmer von den L1 Larven zu trennen, wird das Falkon aufrecht hingestellt. Dabei
sinken die Zelltrümmer schneller ab als die L1 Larven. Deshalb wird der Überstand in ein
frisches Falkon überführt.
2.2.3 Gewinnung des Wurmmaterials für die RNA-Präparation
Im nachfolgenden Versuch soll staged RNA verwendet werden, d.h. die RNA stammt aus
einem Larvenstadium. Wir haben drei Larvenstadien untersucht, dabei handelt es sich um
die Larvenstadien L2, L3 und L4. Man beginnt für jeden Stamm mit drei 9 cm-Platten,
welche mit einer gemischten Kultur überwachsen ist. Diese drei Platten werden auf 20x 9
cm Platten verteilt. Man lässt die Würmer solange wachsen, bis genügend adulte Würmer
für eine Egg-Prep vorhanden sind. Je nach Stamm können sich hier Unterschiede in der
benötigten Entwicklungszeit ergeben. Im Anschluss an die Egg Prep werden die Würmer
unter dem Mikroskop ausgezählt und 3000-4000 Würmer je 9 cm-Platte auf 10 dieser
Platten gegeben. Erneut wartet man bis die Würmer für eine Egg Prep ausreichend weit
entwickelt sind. Nach der 2. Egg Prep werden alle L1 Larven auf 30x 9 cm-Platten verteilt.
Dabei werden je 10 Platten für ein Larvenstadium benötigt. Aufgrund der
unterschiedlichen Entwicklungsdauer ist es sinnvoll die L1 Larven nicht immer zur
gleichen Zeit auf die Platten zu verteilen. Hier sollte man sich einen Zeitplan erstellen, der
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