pep-2 - Lehrstuhl für Ernährungsphysiologie - TUM

2.2.9 Primerdesign
Die unter Punkt 2.1.5.1 aufgeführten Primer wurden mit der LightCycler ® Probe Design
Software designed. Dazu wird in der National Libary of Medicine (Pubmed) [65] und in
der Wormbase [66] nach den entsprechenden CDS bzw. mRNA-Sequenzen gesucht,
welche in das Programm eingegeben werden. Die Auswahl geeigneter Primerpaare richtet
sich dabei nach der Schmelztemperatur Tm, die für die zusammengehörenden Primer
möglichst gleich sein sollte, nach der Spezifität für das zu amplifizierende Gen, nach der
möglichst geringen Ausbildung von Primerdimeren oder Hairpins und nach der Lage von
mindestens einem der beiden Primer eines Paares auf einer Exon-Intron-Grenze.
2.2.10 Primeretablierung
Ein Primeretablierung ist nötig, um die geeignetste Annealingtemperatur des jeweiligen
Primerpaares zu ermitteln, bei der zum einen das gewünschte Produkt gebildet wird und
zum anderen keine Primerdimer und Hairpins entstehen. Zunächst wird eine Lightcycler
Amplifikation durchgeführt, deren Qualität im Anschluss durch eine Agarose-
gelelektrophorese überprüft wird.
2.2.10.1 Lightcycler-Amplifikation
Die Lightcycler-Amplifikation wird entsprechend dem Protokoll unter Punkt 2.2.8.2
durchgeführt, wobei jedoch der Mastermix bereits Kontroll-cDNA enthält. Es werden
9,6 µl Mastermix in die Kapillaren vorgelegten und je 0,2 µl der Primer hinzupipettiert.
2.2.10.2 Agarosegelelektrophorese
Zur Überprüfung der Qualität der Lightcycler-Amplifikation und der Primerspezifität,
werden die Kapillaren überkopf in 1,5 ml Eppendorfgefäße gestellt, in welche 2 µl 10x
Probenpuffer vorgelegt werden. Die Kapillaren werden dann kurz anzentrifugiert, um den
Inhalt der Kapillaren in den 1,5 ml Eppendorfgefäßen zu sammeln. Diese Proben mit
einem Volumen von ca. 12 µl können nun zusammen mit 5 µl Längenstandard Gene
Ruler TM DNA Ladder Mix auf ein 1,5-2 %iges Agarosegel aufgetragen werden. Als
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