pep-2 - Lehrstuhl für Ernährungsphysiologie - TUM

Die real-time RT-PCR-Reaktion wird häufig für die Quantifizierung physiologisch
bedeutender Änderungen in der Genexpression eingesetzt [67]. Die Verwendung eines
LightCyclers ® (Roche) zusammen mit dem Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen (SYBR ®
Green I) ermöglichen eine sehr empfindliche und schnelle Erfassung dieser Änderungen
[37].
Der Fluoreszenzfarbstoff SYBR ® Green I bindet an der kleinen Furche der DNA
Doppelhelix. Befindet sich der Farbstoff frei in der Lösung, kommt es nur zu einer sehr
geringen Fluoreszenz, jedoch erhöht sich die Fluoreszenz sehr stark, wenn der Farbstoff
die DNA bindet. Folgende Abbildungen sollen das Prinzip verdeutlichen:
A B
C
Abb. 17: Prinzip der SYBR Green Technik. (A) Zu Beginn der Amplifikation beinhaltet
das Reaktionsgemisch hauptsächlich denaturierte DNA, an die der Farbstoff nicht bindet
und dieser somit nur frei in der Lösung vorliegt. Die geringe Fluoreszenz der freien
Farbstoffmoleküle verursachen nur ein sehr schwaches Hintergrund-Fluoreszenzsignal. (B)
Durch die Anlagerung der Primer, binden einige Farbstoffmoleküle an den
doppelsträngigen DNA-Strang. Nach Anregung ist eine starke Zunahme der emittierten
Fluoreszenz der SYBR ® Green I Moleküle zu beobachten. (C) Während der Elongation
kommt es immer häufiger zur Anlagerung der Fluoreszenz-farbstoffmoleküle an die neu
synthetisierte DNA. Die Emission des Lichtes ist dabei proportional zur Anzahl der neu
gebildeten DNA-Stränge [64].
42