pep-2 - Lehrstuhl für Ernährungsphysiologie - TUM

Lehrstuhl für Ernährungsphysiologie der Technischen
Universität München, Weihenstephan
mRNA-Expression ausgewählter
Aminosäuretransporter und Schlüsselgene der
Glutathionsynthese in pep-2-Knockout
Caenorhabditis elegans-Stämmen
Masterarbeit
gestellt von:
Prof. Dr. Hannelore Daniel
Bearbeitungszeitraum: Januar 2005-Juli 2005
vorgelegt von: Cordula Pertl
1. Gutachter: PD Dr. G. Kottra
2. Gutachter: Prof. Dr. J. Buchner

Inhaltsverzeichnis
1Einleitung...................................................................................................................................5
1.1 Allgemeines zum in vivo-Modell Caenorhabditis elegans .................................................. 5
1.2 Auswirkung des pep-2 Knockouts auf ausgewählte Signaltransduktionswege (TOR,
DAF-2/Insulin/IGF) ............................................................................................................. 7
1.2.1 Das C. elegans Gen pep-2 ................................................................................................. 7
1.2.2 TOR (target of rapamycin)-Signaltransduktionsweg ........................................................ 8
1.2.3 DAF-2/Insulin/IGF-Signaltransduktionsweg .................................................................. 10
1.2.4 Zusammenhang zwischen Aminosäuremetabolismus, TOR-Signaltransduktionsweg
und DAF-2/Insulin/IGF-Signaltransduktionsweg ........................................................... 12
1.3 Hintergrundinformationen zu den untersuchten Genen...................................................... 14
1.3.1 Allgemeiner Hintergrund ................................................................................................. 14
1.3.2 Heteromere Aminosäuretransporter in C. elegans und deren Säugetierhomologe ........ 16
1.3.2.1 Das LAT1 System ........................................................................................................ 18
1.3.2.2 Der Vertreter des y + L Systems: y + LAT2 ...................................................................... 18
1.3.2.3 Der Vertreter des asc Systems: ASC1 .......................................................................... 19
1.3.2.4 Das x - c System .............................................................................................................. 20
1.3.2.5 Der Aminosäuretransporter AAT-1 .............................................................................. 20
1.3.2.6 Der Aminosäuretransporter AAT-3 .............................................................................. 21
1.3.2.7 Der Aminosäuretransporter AAT-9 .............................................................................. 21
1.3.3 Lysosomale Aminosäuretransporterhomologe ................................................................ 22
1.3.4 GCS-1 (γ-Glutamyl-Cystein Synthetase) ........................................................................ 23
1.3.5 NHX-2 ............................................................................................................................. 25
1.4 Zielsetzung ......................................................................................................................... 25
2 Material und Methoden..........................................................................................................27
2.1 Material ............................................................................................................................... 27
2.1.1 Chemikalien ..................................................................................................................... 27
2.1.2 Zusammensetzung der Medien, Medienzusätze, Versuchspuffer und Arbeitslösungen . 28
2.1.3 Geräte............................................................................................................................... 31
2.1.4 Informationen zu den untersuchten C. elegans Stämmen ............................................... 32
2.1.4.1 N2 Bristol ..................................................................................................................... 32
2.1.4.2 BR2742 ......................................................................................................................... 32
2.1.4.3 BR2688 ......................................................................................................................... 32
2

2.1.4.4 BR3061 ......................................................................................................................... 32
2.1.5 Informationen zu den verwendeten Primerpaaren ........................................................... 33
2.1.5.1 Primer für die LightCycler ® Amplifikationen .............................................................. 33
2.1.5.2 Primer für PCR-Amplifikationen zur Identifizierung des Mutanten Allels
pep-2(lg 601) ................................................................................................................ 34
2.2 Methoden ............................................................................................................................ 35
2.2.1 Aufzucht von C. elegans ................................................................................................. 35
2.2.2 Synchronisieren der Würmer (Egg Prep) ........................................................................ 35
2.2.3 Gewinnung des Wurmmaterials für die RNA-Präparation.............................................. 36
2.2.4 Auszählen der L1 Larven nach der Egg Prep .................................................................. 37
2.2.5 RNA Präparation ............................................................................................................. 37
2.2.6 Bestimmung der RNA-Konzentration ............................................................................. 38
2.2.7 RNA-Kontrollgel ............................................................................................................. 38
2.2.8 Lightcycler real-time RT-PCR ........................................................................................ 39
2.2.8.1 cDNA Synthese ............................................................................................................ 39
2.2.8.2 Lightcycler-Amplifikation ............................................................................................ 40
2.2.9 Primerdesign .................................................................................................................... 44
2.2.10 Primeretablierung .......................................................................................................... 44
2.2.10.1 Lightcycler-Amplifikation .......................................................................................... 44
2.2.10.2 Agarosegelelektrophorese .......................................................................................... 44
2.2.10.3 Auswertung der PCR-Amplifikationen und Datenanalyse ......................................... 45
2.2.11 Identifizierung des pep-2 Knockouts in den Wurmstämmen pep-2, pep-2;daf-2 und
pep-2;daf-2;daf-16 .......................................................................................................... 45
2.2.11.1 Wurmlyse ................................................................................................................... 46
2.2.11.2 Wurm-PCR ................................................................................................................. 46
2.2.11.3 Agarosegelelektrophorese .......................................................................................... 47
2.2.11.4 Vereinzeln der pep-2;daf-2;daf-16 Würmer............................................................... 47
3 Ergebnisse...............................................................................................................................48
3.1 Identifizierung des pep-2(lg601) Knockouts in den Wurmstämmen pep-2, pep-2;daf-2
und pep-2;daf-2;daf-16 ...................................................................................................... 48
3.2 „Aufspüren― eines Wurmes mit dem Tripelknockout pep-2;daf-2;daf -16 ....................... 49
3.2.1 Vorauswahl der Kandidaten ............................................................................................ 49
3.2.2 Überprüfung der Kandidaten aus der Vorauswahl .......................................................... 51
3.3 RNA-Präperationen ........................................................................................................... 52
3

3.4 Primeretablierung .............................................................................................................. 53
3.5 Lightcycler real-time RT-PCR .......................................................................................... 55
3.5.1 Heteromere Aminosäuretransporter ................................................................................ 56
3.5.2 Glykoproteinuntereinheiten der heteromeren Aminosäure-transporter .......................... 65
3.5.3 Lysosomale Aminosäuretransporterhomologe................................................................ 67
3.5.4 gcs-1 ................................................................................................................................ 70
3.5.5 nhx-2 ................................................................................................................................ 72
3.5.6 Zusammenfassung der Ergebnisse .................................................................................. 73
4 Diskussion..............................................................................................................................75
4.1 mRNA-Expression in pep-2 Knockoutstämmen ............................................................... 76
4.2 Effekte auf die mRNA-Expression der heteromeren Aminosäuretransporter ................. 78
4.2.1 Effekte auf die mRNA-Expression des heteromeren Aminosäuretransporters AAT-1 .. 79
4.2.2 Effekte auf die mRNA-Expression des heteromeren Aminosäuretransporters AAT-2 .. 80
4.2.3 Effekte auf die mRNA-Expression des heteromeren Aminosäuretransporters AAT-3 .. 81
4.2.4 Effekte auf die mRNA-Expression des heteromeren Aminosäuretransporters AAT-9 .. 81
4.2.5 Effekte auf die mRNA-Expression der schweren Untereinheit ATG-2 der
heteromeren Aminosäuretransporter ............................................................................... 82
4.3 Effekte auf die mRNA-Expression lysosomaler Aminosäuretransporterhomologe ......... 82
4.4 Effekte auf die mRNA-Expression der -Glutamylcystein Synthetase GCS-1 ................. 85
4.5 Effekte auf die mRNA-Expression Na + /H + -Austauschers NHX-2 ................................... 86
5 Zusammenfassung ............................................................................................................. 89
6 Summary.............................................................................................................................90
7 Literaturverzeichnis ........................................................................................................... 91
8 Abbildungsverzeichnis ...................................................................................................... 97
9 Tabellenverzeichnis ......................................................................................................... 100
10 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................... 101
11 Danksagung ..................................................................................................................... 104
12 Eidesstattliche Erklärung ................................................................................................. 105
4

1 Einleitung
1.1 Allgemeines zum in vivo-Modell Caenorhabditis elegans
Die Bemühungen des Molekularbiologen Sydney Brenner am Medical Research Council
(MRC) Laboratory of Molecular Biology in Cambridge, UK waren 1963 ausschlaggebend
für die Etablierung von C. elegans als Modellorganismus. Er vertrat die Meinung, dass
C. elegans zahlreiche experimentelle Vorteile zur Identifizierung von Genen bietet, die bei
der Entwicklung beteiligt sind. Zu diesen Vorteilen gehören die kurze Generationsdauer,
der kurze Lebenszyklus, die große Anzahl an Nachkommen durch sexuelle Reproduktion,
die geringe Zellzahl und Zellinvarianz und die leichte und preiswertere Handhabung im
Labor [48]. Zudem liegt seit 1998 das gesamte entschlüsselte Genom dieses Organismus
mit rund 17 900 Genen vor [7].
C. elegans ist dem Phylum Nematoda oder den Rundwürmern zuzuordnen. Wobei
C. elegans zu den freilebenden, nichtparasitären Spezies zählt, die sich im Boden von
Bakterien ernähren und dort eine Größe von ~ 1 mm erreichen. Unter dem Mikroskop ist
jede Zelle aufgrund der durchsichtigen Cuticula des Wurms gut zu beobachten [48].
Abb. 1: Rasterelektronenaufnahme eines Caenorhabditis elegans Hermaphroditen [24].
Erwachsene Würmer kommen hauptsächlich als Hermaphroditen vor, welche sowohl
Eizellen als auch Spermien produzieren und durch Selbstbefruchtung eine
Nachkommenzahl von etwa 300 erreichen (Abb. 2A). Nur ~ 0,1 % einer
5

Wildtyppopulation stellen Männchen dar (Abb. 2B). Die Nachkommenzahl bei einer
Befruchtung durch ein Männchen beträgt ~ 1000, da in diesem Fall deutlich mehr
Spermien zur Verfügung stehen [48]. Hermaphroditen besitzen zwei X Chromosomen,
während Männchen durch gelegentliche Non-Disjunktion der X Chromosomen bei der
Meiose den XO Karyotyp aufweisen [24].
Unter optimalen Bedingungen beträgt die durchschnittliche Lebensspanne von C. elegans
2-3 Wochen [48].
Abb. 2: Morphologie von C. elegans. A: mikroskopische Ansicht [24] B: Detailzeichnung
mit Beschriftung [48].
Abb. 3: Lebenszyklus von C. elegans [24].
6

Die Embryogenese, d.h. die Entwicklung von der Befruchtung bis zum Schlüpfen, beträgt
bei 25°C etwa 14 h. Die postembryonale Entwicklung umfasst vier Larvenstadien (L1-L4)
und dauert bis zur Ausbildung eines adulten, geschlechtsreifen Wurms drei Tage. Falls
nicht ausreichend Nahrung vorhanden ist, kann der Wurm nach der zweiten Häutung in
eine alternative Entwicklungsform, dem Dauerlarvenstadium, übergehen. In diesem
Stadium kann der Wurm durch Anpassungen in Struktur, Metabolismus und Verhalten für
mehrere Monate unter schlechten Bedingungen überleben. Wenn sich die Bedingungen
wieder verbessert haben, ist es dem Wurm möglich die Entwicklung zum adulten Tier
fortzusetzen. Der erwachsene Hermaphrodit besteht aus 959 somatischen Zellen. Die
Männchen besitzen dagegen 1031 somatische Zellen. Der Wurm weist viele Gewebe und
Organe auf, die auch bei komplexeren Tieren zu finden sind. Zu diesen Geweben und
Organen gehören Muskeln, ein Nervensystem, Gonaden, Epidermis und ein
Gastrointestinaltrakt mit Pharynx, Darm und Rektum [48]. Diese Gewebe und Organe sind
jedoch sehr viel einfacher aufgebaut. So findet man z.B. 302 Neuronen und 95
Muskelzellen [24]. Diese Einfachheit, kombiniert mit dem hohen Grad an Differenzierung
macht C. elegans zu einem guten Modell für die Beschreibung des Schicksals einzelner
Zellen bei der Entwicklung.
1.2 Auswirkung des pep-2 Knockouts auf ausgewählte Signal-
transduktionswege (TOR, DAF-2/Insulin/IGF)
1.2.1 Das C. elegans Gen pep-2
In allen Organismen werden Aminosäuren mittels einer Vielzahl von integralen Zell-
membrantransportern als freie Aminosäuren oder in einer peptid-gebundenen Form in die
Zelle aufgenommen. In Säugetieren wird die Aufnahme von Di- und Tripeptiden und von
Peptidomimetika über die apikalen Darmepithelzellen durch den Peptidtransporter PEPT1
vermittelt. Im Genom von Caenorhabditis elegans findet man das zum humanen pept1
Gen homologe Gen pep-2. Es kodiert für das Protein PEP-2. Jedoch besteht zwischen den
abgeleiteten Transportprotein aus C. elegans und dem Protein im Säugetier nur eine
geringe Übereinstimmung von 36,9 % in der Aminosäuresequenz. Dem steht aber eine
hohe Übereinstimmung der in vitro Transportcharakteristik des C. elegans und des
Säugetier Orthologen in Xenopus Laevis Oocyten gegenüber. PEP-2 stellt eine Isoform
7

eines protonen-gekoppelten Peptidtransporters mit niedriger Affinität aber hoher Kapazität
dar. Es spielt eine bedeutende Rolle in der intestinalen Absorption von peptid-gebunden
Aminosäuren, wodurch deutlich wird, dass PEP-2 für die Aminosäureversorgung des
Organismus enorm wichtig ist. Die Expression von pep-2 kann mit Hilfe von pep-2
promotor-gesteuerten Reporterkonstrukten entlang der apikalen Membran der Darmzellen
und in einem Paar sensorischer Neuronen (ASI) im Kopf des Tieres lokalisiert werden.
Ein Mutantenstamm mit einem Defekt im pep-2 Genlokus ist nicht fähig Dipeptide zu
resorbieren. Diese Würmer weisen eine verzögerte Entwicklung, eine geringere
Nachkommenzahl und Körperlänge und eine erhöhte Stresstoleranz auf. Ähnliche
Phänotypen konnten in anderen Organismen mit Defekten im TOR-
Signaltransduktionsweg beobachtet werden. Es konnte gezeigt werden, dass pep-2 sowohl
mit dem Ziel von Rapamycin (TOR) in C. elegans als auch mit dem DAF-2/Insulin/IGF-
Signaltransduktionsweg in Verbindung steht [35]. Der genaue Zusammenhang wird unter
Punkt 1.2.4. erläutert.
1.2.2 TOR (target of rapamycin)-Signaltransduktionsweg
In vielzelligen Organismen ist Zellwachstum und -proliferation nicht nur genetisch
bestimmt, sondern hängt auch von den Umweltbedingungen wie der Nährstoffzufuhr ab
[23]. Hier spielt der TOR-Signaltransduktionsweg eine wichtige Rolle, indem er das
Gleichgewicht zwischen Proteinbiosynthese und Proteindegradation entsprechend der
Nährstoffmenge und –qualität koordiniert [44]. Das TOR-Protein stellt eine stark
konservierte Proteinkinase dar. Sie gehört zu einer Familie von Phosphatidylinositolkinase-
abhängigen Kinasen (PIKKs). TOR wird durch das lipophile Makrolid Rapamycin
inhibiert. Der intrazelluläre Rezeptor für Rapamycin in Eukaryonten ist die
Prolylisomerase FKBP12 [44]. Der TOR-Signaltransduktionsweg bewerkstelligt die
Detektion des zellulären Bestandes an Aminosäuren. Er ist an der Regulation
verschiedener zellulärer Prozesse, wie z.B. der Transkription zahlreicher an metabolischen
Signalwegen beteiligter Enzyme, der Initiations- und Elongationsphasen der Translation,
der Ribosomenbiosynthese, des Aminosäureimports und der Proteindegradation beteiligt
[44].
8

Abb. 4: Einfluss des Nährstoffstatus auf die Regulation der Proteinsynthese und der
Proteindegradation [44].
Die TOR-Proteine scheinen nicht als Komponenten eines linearen Signalweges zu wirken,
sondern eher an Kontrollpunkten zur Ermittlung des Nährstoffstatus (siehe Abb. 4) [44].
Ein Verlust der TOR-Funktion führt in C. elegans zu einem Entwicklungsstopp im
Larvenstadium L3 und einer intestinaler Atrophie. Mit dieser Atrophie geht das
Vorkommen großer, aufgebrochener Lysosome einher. Zudem verschwinden zunehmend
normale Populationen intestinaler Vesikel, sowie intestinales Zellzytoplasmas. Dieses
Verschwinden wird begleitet von einer reziproken Vergrößerung des intestinalen Lumens
[30]. Der TOR-Signaltransduktionsweg nimmt auch Einfluss auf die Lebensspanne, was
vermuten lässt, dass hier eine Interaktion mit dem DAF-2/Insulin/IGF-Signalweg besteht
und somit eine Verbindung zwischen Nährstoffzufuhr, Metabolismus und Langlebigkeit
existiert [55].
DAF-2/Insulin/IGF-Signaltransduktionsweg und TOR-Signaltransduktionsweg regulieren
ein gemeinsamen Satz an Effektoren, die am Zellwachstum beteiligt sind, einschließlich
der Translationinitiationsfaktoren 4E-Bindeprotein (4EBP1) und S6 ribosomale
Proteinkinase (S6K) [23].
9

Abb. 5: Interaktionen der verschiedenen Signalwege mit dem TOR Signalweg im
Säugetier und deren Auswirkung auf die eukaryotische Translationsmaschinerie [44].
1.2.3 DAF-2/Insulin/IGF-Signaltransduktionsweg
Sowohl in Drosophila als auch im Säugetier wirkt sich die Menge der Proteine und
Aminosäuren, die aus der Nahrung zur Verfügung stehen, auf den DAF-2/Insulin/IGF-
Signaltransduktionsweg aus, wodurch der Metabolismus und das Wachstum kontrolliert
wird [35]. In C. elegans kodiert das daf-2 Gen für einen DAF-2/Insulinrezeptor. Abwärts
von diesem Rezeptor befinden sich die Komponenten AGE-1/Phosphatidylinositol 3-
Kinase, PDK-1/PDK1, die AGC Kinasen AKT-1/-2 und SGK-1, PKB, DAF-18/PTEN und
der Forkhead-Transkriptionsfaktor DAF-16/FKHRL1/FOXO [35].
10

Abb. 6: Modell für den DAF-2/Insulin/IGF-Signalweg [22].
In Nematoden aktiviert die Inhibition des DAF-2/Insulinrezeptors den Transkriptionsfaktor
DAF-16. Dies hat eine erhöhte Lebensdauer und die Resistenz gegenüber verschiedener
Stresstypen zur Folge [28]. DAF-16 spielt eine Schlüsselrolle in der Hitze- und
Stressresistenz, Fettspeicherung, der Dauerlarvenbildung in der Entwicklung, der
Reproduktion und dem Metabolismus [49]. Der DAF-2/Insulin/IGF Signalweg reguliert in
C. elegans Alterungsprozesse, Reproduktion, den Lipidmetabolismus und die
Dauerlarvenbildung unabhängig von einander [13].
In Wirbeltieren führt FOXO, das DAF-16 Homolog, zur Erhöhung der Expression von
Genen, welche die Reparatur von DNA (z.B. GADD45a) und den Schutz gegen oxidative
Schädigung (z.B. Mn-SOD) fördern. Zudem resultiert eine FOXO-Aktivierung in der
verminderten Expression von Genen, die das Fortschreiten des Zellzyklus verursachen (D-
Typ Cycline) [49].
11

1.2.4 Zusammenhang zwischen Aminosäuremetabolismus, TOR-
und DAF-2/Insulin/IGF-Signaltransduktionsweg
In Wildtypstämmen führt der Aminosäure- und Peptidtransport über den TOR-
Signaltransduktionsweg, ebenso wie über den aktivierten DAF-2/Insulin/IGF-
Signaltransduktionsweg zu einem normalen Wachstum, einer normalen Entwicklung und
Reproduktion. Dabei ist DAF-16 inaktiv, wodurch die Lebensspanne unauffällig ist. Es
konnte gezeigt werden, dass PEP-2 upstream des TOR-vermittelten
Signaltransduktionsweges eingreift.
Abb. 7: Interaktionen des TOR-Signaltransduktionsweges und des DAF-2/Insulin/IGF-
Signal-transduktionsweges mit dem Peptidtransporter PEP-2 im C. elegans Wildtypstamm
[35].
In Folge eines pep-2-Defekts wird der Di- und Tripeptidtransport reduziert. Dies resultiert
in einem erniedrigten intrazellulären Aminosäurespiegel, wodurch die TOR-Funktion
beeinträchtigt wird und eine Veränderung der Regulation der Proteinbiosynthese durch den
TOR-Signalweg entsteht. Der direkte Einfluss der PEP-2-Funktion auf den TOR-
Signaltransduktionsweg konnte nachgewiesen werden, indem pep-2 Würmer mit
doppelsträngiger (ds)RNA gefüttert wurden, die einen schwachen Knockdown des let-363
Gens (C. elegans TOR) hervorruft. Die zusätzliche Reduktion der TOR-Aktivität führt in
pep-2 zu einer deutlichen Verstärkung des bereits vorhandenen Phänotyps [35].
12

Auswirkungen sind ein deutlich geringeres Wachstum, eine stark verzögerte Entwicklung
und eine reduzierte Nachkommenzahl. Dieses Ergebnis zeigt, dass die TOR-Funktion eng
mit der PEP-2-Funktion gekoppelt ist.
Des weiteren ist der DAF-2/Insulin/IGF Signaltransduktionsweg voll aktiv, wodurch DAF-
16 gehemmt ist. Somit finden keine Prozesse statt, die durch Veränderungen in der
Genexpression zu Verlängerungen der Lebensspanne führen. Die Erniedrigung der durch
oxidativen Stress geschädigten Proteine ist hier nicht ausreichend für eine Zunahme der
Lebensdauer.
Abb. 8: Auswirkung der Interaktion des TOR-Signaltransduktionsweges und des DAF-
2/Insulin/IGF-Signaltransduktionsweges mit dem Peptidtransporter PEP-2 in C. elegans
vor dem Hintergrund eines pep-2 Knockouts [35].
Eine zusätzliche Mutation von daf-2 verstärkt die Defekte im Wachstum, der Entwicklung
und Reproduktion parallel zu pep-2. Die daf-2 und pep-2 Einzelmutanten weisen eine
vergleichbare Beeinträchtigung der postembryonalen Entwicklung und der
Nachkommenzahl auf. Jedoch ist die Ausprägung dieser Phänotypen in der daf-2;pep-2
Doppelmutante noch verstärkt. Darüber hinaus ist nun auch DAF-16 aktiv, da der DAF-
2/Insulin/IGF-Signaltransduktionsweg ausgeschaltet ist. Dadurch treten Änderungen in der
Genexpression ein, welche die Langlebigkeit dieses Mutantenstammes bewirken. Der pep-
2 Mutantenhintergrund trägt zur Langlebigkeit vermutlich dadurch bei, dass die reduzierte
Verfügbarkeit von Aminosäuren zur Verminderung der Anhäufung von Proteincarbonylen
während der Alterung führt. Somit konnte eine Korrelation zwischen der Lebensdauer und
13

dem oxidativen Stress, der Proteine durch die Einführung von Carbonylgruppen schädigt,
gefunden werden [35].
Abb. 9: Auswirkungen der Interaktion des TOR-Signaltransduktionsweges und des DAF-
2/Insulin/IGF-Signaltransduktionsweges mit dem Peptidtransporter PEP-2 in C. elegans
vor dem Hintergrund eines pep-2; daf-2 Knockouts [35].
Demzufolge spielt der intestinale Peptidtansporter eine sehr wichtige Rolle bei der
Bereitstellung von Aminosäuren für Wachstum und Entwicklung. Weiterhin weisen die
Befunde auf eine enge Verbindung des Aminosäurestoffwechsels mit dem DAF-
2/Insulin/IGF-Signaltransduktionsweg, der Toleranz gegen oxidativen Stress und
Alterungsprozessen hin [35].
1.3 Hintergrundinformationen zu den untersuchten Genen
1.3.1 Allgemeiner Hintergrund
Wie bereits zuvor unter Punkt 1.2.1 beschrieben wurde, handelt es sich bei PEP-2 um
einen Peptidtransporter, welcher über die Aufnahme von Peptiden auf den TOR- und DAF-
2/Insulin/IGF-Signalweg Einfluss nimmt. Hier wird dem intrazellulären Aminosäurepool,
welcher sowohl durch die Aktivität von PEP-2 als auch durch die Aktivität von
Aminosäuretransportern hervorgerufen wird, eine besondere Bedeutung zugemessen [35].
14

Fehlt nun die PEP-2 Funktion, beobachtet man eine erhöhte Aufnahme neutraler
Aminosäuren in pep-2 C. elegans [Spanier, unveröffentlichte Daten], welche auf
Kompensationsreaktionen zurückgeführt werden könnte. In der vorliegenden Arbeit sollte
aufgeklärt werden, um welche Aminosäuretransporter es sich handelt, die diese erhöhte
Aufnahme vermitteln. Deshalb wurden elf Gene (aat-1 bis aat-6, aat-8 und aat-9; atg-1
und atg-2) ausgewählt, welche für heteromeren Aminosäuretransporter kodieren [53, 54].
Da nicht alle dieser C. elegans Transporter bisher genau untersucht wurden, wird im
Folgenden genauer auf deren Säugetierhomologe eingegangen (1.3.2).
Neben diesen heteromeren Aminosäuretransportern wurden in dieser Arbeit auch
lysosomale Aminosäuretransporterhomologe aus C. elegans untersucht. Damit wird
beabsichtigt einen möglichen weiteren Kompensationsmechanismen abzuklären. Der
Verringerung der Aminosäurezufuhr von Außen, könnte eine effektivere
Wiederverwertung bereits intrazellulär vorhandener Aminosäurebestände gegenüberstehen,
die durch eine erhöhte Ausschleusung von Aminosäuren aus dem Lysosom über die
lysosomalen Aminosäuretransporter vermittelt werden könnte. Da auch hier in C. elegans
noch nicht besonders viel über die beiden Transporter Y43F4B.7 und T27A1.5 bekannt ist,
wird anschließend das Säugetierhomolog ausführlicher beschrieben (siehe 1.3.3).
Im C. elegans pep-2 Knockoutstamm beobachtet man auch eine erhöhte Resistenz
gegenüber oxidativen Stress [35]. Zudem ist bekannt, dass sowohl der Insulin-, als auch
der TOR-Signalweg in der Ratte die Glutathionsynthese beeinflussen [27]. Das
Schlüsselgen der Glutathionneusynthese ist in C. elegans gcs-1. Um zu überprüfen, ob die
erhöhte Resistenz gegen oxidativen Stress in diesem Knockoutstamm auf die Aktivität von
GCS-1 zurückzuführen ist und ob eine Regulation durch diese beiden
Signaltransduktionswege stattfindet, wurde auch gcs-1 in dieser Arbeit untersucht. Darüber
hinaus konnte im Säugetier für die Lysosomen eine wichtige Rolle bei der Antwort der
Zellen auf oxidativen Stress nachgewiesen werden [36]. Hier können die beiden
untersuchten lysosomalen Aminosäuretransporterhomologe wieder herangezogen werden,
um den Zusammenhang in C. elegans ansatzweise zu beleuchten.
Ein zusätzliches Gen, welches analysiert wurde, ist nhx-2. Dabei handelt es sich um einen
Na + /H + -Austauscher. Die PEP-2-Funktion ist eng mit der NHX-2-Funktion gekoppelt [41].
Deshalb ist es interessant zu untersuchen, wie sich ein Knockout von pep-2 auf der
mRNA-Ebene auf nhx-2 auswirkt.
15

1.3.2 Heteromere Aminosäuretransporter in C. elegans und deren
Säugetierhomologe
Das Genom von Caenorhabditis elegans beinhaltet > 750 Gene, die Proteine kodieren,
welche vermutlich an Transmembrantransportprozessen beteiligt sind. C. elegans verfügt
über elf Gene (aat-1 bis aat-9 und atg-1 und atg-2), welche für Proteine kodieren, die
homolog zu den heteromeren Aminosäuretransporter (mHATs) im Säugetier sind. Diese
sind aus zwei Untereinheiten aufgebaut, einer multi-transmembrandurchspannenden (12
transmembrane Domänen) katalytischen Untereinheit (leichte Untereinheit) und einem
einfach-membrandurchspannenden Typ II Glykoprotein (z.B. rBAT bzw. 4F2hc, schwere
Untereinheit). Die zwei Untereinheiten sind über eine Disulfidbrücke assoziiert [54]. Die
schwere Untereinheit 4F2hc aus Säugern, mit einem Molekulargewicht von 80 kDa [6],
kann mit sieben verschiedenen leichten Untereinheiten interagieren und ist hauptsächlich
daran beteiligt die assoziierten leichten Untereinheiten an den Bestimmungsort zu bringen
und zu stabilisieren. Die leichten Untereinheiten stellen polytopische Membranproteine mit
12 Transmembrandomänen dar, welche die Spezifität des Transportsystems bestimmen.
Daraus entstehen verschiedenste Transporter der Syteme L, y + L, asc oder x - c. Heteromere
Aminosäuretransporter unterliegen meist einem Antiportmechanismus, welcher zum
Austausch von Aminosäuren führt [9]. In C. elegans findet man zwei Gene atg-1 und atg-
2, die Proteine kodieren, welche homolog zu den heteromeren Aminosäuretransporter Typ
II Glycoproteinuntereinheiten sind.
Abb. 10: Stammbaum der heteromeren Aminosäuretransporter Typ II Glyko-
proteinuntereinheiten aus Säugetier und C. elegans [54].
16

Drei der C. elegans Aminosäuretransporterproteine (AAT-1 bis AAT-3) weisen eine
wesentlich höhere Ähnlichkeit zu den Säugetierhomologen auf als die anderen sechs
Proteine (AAT-4 bis AAT-9).
Abb. 11: Stammbaum der katalytischen Untereinheiten der Aminosäuretransporter aus
Mensch und C. elegans [54].
Auffällig ist dabei vor allem das Vorhandensein eines Cysteinrestes an der Position, von
der bekannt ist, dass dort in den mHATs die Disulfidbrücke zum Glycoprotein entsteht.
Das Fehlen des Cysteinrestes in den anderen sechs C. elegans aat-Genprodukten (AAT-4
bis AAT-9) könnte darauf hinweisen, dass diese Proteine diese Disulfidbrücke zur
Stabilisierung der Assoziation mit der schwere Untereinheit nicht benötigen oder dass
bereits ein funktionelles Protein ohne die Assoziation mit einem Glykoprotein vorliegt
[54]. In der unten stehende Tabelle sind die Homologien der untersuchten AATs zu einigen
mHATs aufgeführt. Auf diese vier Homologen bzw. Transportsysteme (siehe Tabelle 1)
soll im Folgenden noch genauer eingegangen werden, da über die Charakteristika und
Funktionen der C. elegans Homologen, mit Ausnahme von AAT-1, -3 und -9 (siehe dazu
1.3.2.5, 1.3.2.6 und 1.3.2.7), noch nicht viel bekannt ist.
17

Tabelle 1: Homologien der untersuchten C. elegans AATs zu einigen mHATs [66].
Homolog bzw.
Transportsystem
Organismus
LAT1 M. musculus 98,8 %
18
Homologie
AAT-1 AAT-2 AAT-3 AAT-4 AAT-5 AAT-6 AAT-8 AAT-9
H. sapiens 97,6 % 93,1 %
R. norvegius 96,5 % 98,2 %
y + LAT2/KIAA0245 M. musculus 86,1 % 85,7 % 88,4 %
H. sapiens 96,9 % 82,1 % 85,2 %
ASC1 M. musculus 98,8 %
H. sapiens 98,8 %
R. norvegius 98,8 %
xCT M. musculus 89,1 %
1.3.2.1 Das LAT1 System
H. sapiens 85,8 % 89,1 %
Der Aminosäuretransporter LAT1 gehört zur L-Typ Aminosäuretransporter (LAT)-
Familie. Der Transporter besteht aus einem Heterodimer aus der 40-45 kDa LAT1 leichten
Untereinheit und der schweren Untereinheit 4F2hc, welche über eine Disulfidbrücke
verbunden sind [6]. Bei LAT1 handelt es sich um einen Na + -unabhängigen hochaffinen
Transporter für große neutrale Aminosäuren, welche verzweigte oder aromatische
Seitenketten aufweisen (Leu, Ile, Val, Phe, Tyr, Trp, Met und His). Der Transport erfolgt
mit einer Affinität Km = ~ 15-20 µM. LAT1 transportiert darüber hinaus auch
D-Aminosäuren, wie D-Leu und D-Phe [60]. Er ist an der zellulären Aminosäureaufnahme
beteiligt und vermittelt dort den basolateralen Austausch kleiner, neutraler intrazellulärer
Aminosäuren gegen größere, neutrale extrazelluläre Aminosäuren [54]. Dem Transporter
werden eine Vielzahl von Funktionen beim Aminosäuretransport, bei Prozessen, die das
Überleben von Zellen fördern, bei der Integrinaktivierung und Zellfusion zugeschrieben
[6]. Des weiteren konnte gezeigt werden, dass hLAT1 eine bedeutende Rolle im
Zellwachstum und in der Zellproliferation spielt [60].
1.3.2.2 Der Vertreter des y + L Systems: y + LAT2
Der zweite heteromere Aminosäuretransporter aus Säugetieren, zu dem deutliche
Homologien der C. elegans Aminosäuretransporter gefunden wurden, ist

y + LAT2/KIAA0245 des y + L-Transportsystems. Das y + L System wurde als erstes in
Erythrozyten beschrieben [10, 12]. In polarisierten Epithelien ist das y + L System
basolateral lokalisiert und vermittelt dort den Transport sowohl neutraler als auch basischer
Aminosäuren, wobei intrazelluläre dibasische Aminosäuren gegen große neutrale
extrazelluläre Aminosäuren zusammen mit Na + -Ionen ausgetauscht werden. Somit handelt
es sich, im Gegensatz zum L-System, um einen Na + -abhängigen Aminosäureaustausch.
Der Transport dibasischer Aminosäuren erfolgt mit hoher Affinität (apparent Km 5-10 µM)
[11, 12]. Auch dieses Transportsystem kann nur dann den Aminosäuretransport vermitteln,
wenn die 4F2 leichten Untereinheit assoziiert ist [56].
Humanes y + LAT2 besitzt eine molekulare Masse von ~56 kDa [51]. Eine Expression
konnte in Gehirn, Testis und Parotis nachgewiesen werden, aber auch in einem
schwächeren Ausmaß in Dünndarm, Nieren und Herz. Im Gehirn wird y + LAT2 sowohl in
Neuronen als auch Astrozyten exprimiert [5]. Neben kationischen Aminosäuren bevorzugt
y + LAT2 große neutrale Aminosäuren mit sperrigen Seitenketten. Arginin stellt ein gutes
Substrat dar, welches sowohl aufgenommen als auch ausgeschleust wird. Dagegen werden
Glutamin und Leucin leicht aufgenommen, aber nicht ausgeschleust. Diese Tatsache lässt
auf eine Funktion von y + LAT2 als ein elektroneutraler Arginin/Glutamin-Austauscher
schließen. Somit spielt y + LAT2 eine Rolle in der Aufnahme von Glutamin in die
Neuronen, als Vorstufe für die Glutamatsynthese [5].
1.3.2.3 Der Vertreter des asc Systems: ASC1
Auch das asc System wurde als erstes in Erythrozyten beschrieben, wo es als Na + -
unabhängiges Transportsystem für kleine neutrale Aminosäuren (L-Ser, L-Ala, L-Cys, L-
Gly und L-Thr) identifiziert wurde [1, 15, 52]. Das Gen asc1 kodiert für ein ~53 kDa
Protein. Die stärkste Expression von asc1 wurde in Gehirn und Nieren gefunden [40]. Das
asc System transportiert auch die D-Isomere D-Ser und D-Ala. D-Ser spielt eine wichtige
Rolle im zentralen Nervensystem, da es dort für die Aktivierung des NMDA (Glutamat N-
Methyl-D-Aspartat)-Rezeptors bedeutend ist [18]. Die Affinität von ASC1 für D-Ser liegt
innerhalb der physiologischen Konzentration von D-Ser in der cerebrospinalen Flüssigkeit
(Km 22,8 µM). Damit ist ASC1 möglicherweise an der Modulation der glutamatergen
Transmission beteiligt, indem es die Mobilisierung von D-Ser an der glutamatergen
Synapse beeinflusst [40]. Darüber hinaus haben auch L-Ser und L-Gly eine wichtige
19

Aufgabe als trophische Faktoren für cerebrale Purkinje-Zellen inne [18]. Im Gegensatz zu
den anderen Mitgliedern der 4F2lc Familie weist ASC1 eine Uniport-Aktivität auf [17].
1.3.2.4 Das x - c System
Das x - c System ist das wichtigste Aminosäuretransportsystem zur Bereitstellung von
Cystin für die Zelle [8]. Dies geschieht in einem Na + -unabhängigen Austausch gegen
Glutamat [8]. Sowohl chemischer als auch physikalischer Stress induzieren die Aktivität
dieses Systems in einer Vielzahl von Zelltypen, wie Macrophagen, Neuronen oder
Gliazellen, Fibroblasten, Nierezellen, Pankreaszellen und Hepatozyten. Die Aufnahme von
Cystin und die darauffolgende Reduktion zu Cystein stellen den
geschwindigkeitslimitierenden Schritt in der Glutathionsynthese dar. Somit reguliert das
x - c System direkt die intrazelluläre Konzentration von GSH [46]. GSH ist bedeutend für
die Pufferung intrazellulärer freier Radikale und damit für die Antwort der Zelle auf
oxidativen Stress [8]. Die Synthese von GSH hängt stark von der Verfügbarkeit von Cystin
oder Cystein ab. Cystin wird nur in anionischer Form transportiert [46]. Dabei ist der
Cystin/Glutamat-Transport des x - c Systems elektroneutral [46]. Das Transportprotein x - c
besteht wiederum aus zwei Untereinheiten, xCT und 4F2hc. xCT besteht aus
12-transmembranen Domänen mit 501 Aminosäuren und hat einer molekulare Masse von
~55 kDa [3, 4, 46].
1.3.2.5 Der Aminosäuretransporter AAT-1
Der Aminosäuretransporter AAT-1 in C. elegans bindet kovalent an beide C. elegans ATG
Glycoproteine, aber kann nur gebunden an ATG-2 den Aminosäuretransport ermöglichen,
da nur dieser Komplex an die Zelloberfläche gelangt [54]. AAT-1 transportiert die meisten
kleinen neutralen L-Aminosäuren (Ala, Ser, Val, Thr, His, Gly) und wenige der größeren
neutralen Aminosäuren, z.B. L-Phe und L-Tyr, unabhängig von Na + . Die höchste
Transportrate erreicht AAT-1 für L-Ala und L-Ser (für L-Ala apparent Km 32 µM). Des
weiteren handelt es sich bei AAT-1 um einen obligatorischen Aminosäureaustauscher.
Dieser heteromere Aminosäuretransporter aus C. elegans ähnelt in seiner Struktur und
Transportfunktion dem Aminosäuretransportsystem L und bis zu einem gewissen Grad
auch dem asc-Sytem aus Säugetieren [54]. Wie in der Tabelle 1 aufgeführt, besitzt AAT-1
20

eine Homologie von 98,8 % zur Large neutral amino acids transporter small subunit 1 (L-
type amino acid transporter 1) (4F2 light chain, 4F2LC) aus Mus musculus. Darüber hinaus
findet man eine Übereinstimmung von 97,6 % mit dem humanen Homolog hLAT1 [66].
1.3.2.6 Der Aminosäuretransporter AAT-3
Der AAT-3 Aminosäuretransporter aus C.elegans ist in seiner Transportfunktion und -
charakteristik vergleichbar mit AAT-1. Der Transport ist Na + -unabhängig und es handelt
sich ebenfalls um einen obligatorischen Aminosäureaustauscher. Sie weisen beide eine
hohe Affinität zu kleinen neutralen L-Aminosäuren auf. Auch für AAT-3 gilt, dass nur
dann ein Aminosäuretransport stattfindet, wenn AAT-3 ATG-2 kovalent gebunden hat
[54]. AAT-3/ATG-1 konnte ebenfalls nicht an der Zelloberfläche lokalisiert werden. AAT-
3/ATG-2 weist eine Affinität von 101 µM für L-Ala als Substrat auf. Verglichen mit AAT-
1/ATG-2 wurden die anderen neutralen Aminosäuren bis auf L-Gln von AAT-3/ATG-2
weniger effektiv transportiert [54]. Auch für diesen Aminosäuretransporter aus C. elegans
konnte eine Homologie zu einem Mitglied der LAT-Familie nachgewiesen werden. Dabei
besteht eine Übereinstimmung von 98,2 % mit LAT-1 aus Ratus norvegius und von 93,1 %
mit LAT-1 aus Homo sapiens [66].
1.3.2.7 Der Aminosäuretransporter AAT-9
Neben AAT-1 und AAT-3 gehört AAT-9 zu den bisher genauer untersuchten
Aminosäuretransportern in C. elegans. Wie bereits erwähnt zählt AAT-9 zu den sechs
Homologen der mHATs (AAT-4 bis AAT-9), die sich phylogenetisch stärker von den
katalytischen Untereinheiten der Säugetiere unterscheiden als AAT-1, AAT-2 und AAT-3.
Im Gegensatz zu diesen weisen AAT-4 bis AAT-9 keinen konservierten Cysteinrest an der
Stelle auf, an der vermutet wird, dass die Interaktion mit der schweren Untereinheit
stattfindet, die für die Lokalisation an der Zelloberfläche als notwendig erachtet wird.
AAT-9 gelangt ohne zusätzliche schwere Untereinheit an die Zelloberfläche und kann dort
als obligatorischer Austauscher von aromatischen Aminosäuren (L-Phe, L-Trp und L-Tyr)
und zudem von L-Dopa fungieren [53]. Jedoch wurde beobachtet, dass die Co-Expression
von ATG-1 oder ATG-2 die Aufnahme um bis zu 85 % steigern konnte. Dies führt zu der
Vermutung, dass eine nicht-kovalente Interaktion zwischen leichter und schwerer
Untereinheit dafür verantwortlich ist AAT-9 in der Zellmembran zu stabilisieren. Mittels
21

Immunofluoreszenz konnte die Expression von AAT-9 in vivo in Neuronen zwischen den
zwei Bulbs des Pharynx und in den nach Außen grenzenden Muskeln der Mundregion
lokalisiert werden. Die neuronale Lokalisation und die Selektivität des Transporters für
aromatische Aminosäuren lässt vermuten, dass eine mögliche Funktion des Transporters
darin liegt, Vorstufen von Transmittern, wie Serotonin und Dopamin, den Zellen zur
Verfügung zu stellen. Darüber hinaus führt die Tatsache, dass man AAT-9 auch in der
Nachbarschaft der Bulbs des Pharynx in möglicherweise chemosensorischen Neuronen
findet, zu der Annahmen, dass unter Umständen hier ein Zusammenhang mit dem
Auffinden von Futter und Futterbestandteilen besteht. Des weiteren konnte eine
substrataktivierte Anionenleitfähigkeit erfasst werden. Diese Beobachtungen und die
Tatsache, dass AAT-9 in elektrisch erregbaren Zellen, wie Muskelzellen und Neuronen
exprimiert wird, spricht dafür, dass AAT-9 möglicherweise ein Rolle in der Stabilisierung
des Membranpotentials inne hat [53]. Der AAT-9 Aminosäuretransporter aus C. elegans
besitzt eine Homologie von 88,4 % zur y + Large neutral amino acids transporter small
subunit 2 (y + L-type aminosacid transporter 2) aus M. musculus. Darüber hinaus findet
man eine Übereinstimmung von 85,2 % mit dem KIAA0245 Protein/solute carrier family 7
(cationic aa-transporter y + system), member 6 y + LAT2 Homolog aus H. sapiens [66].
1.3.3 Lysosomale Aminosäuretransporterhomologe
Lysosomen bewerkstelligen den Abbau der vier Klassen von Makromolekülen (DNA,
Proteine, Kohlenhydrate und Lipide) [45]. Lysosomaler Abbau trägt sowohl zum normalen
Proteinumsatz als auch zur Elimination beschädigter oder falsch-gefalteter Proteine bei
[58]. Die Abbauprodukte werden anschließend über spezifische Transporter in das Cytosol
transportiert, wo sie wieder in den zellulären Metabolismus eingeschleust werden [45].
Somit stellen Lysosomen ein Organell dar, welches dem Abbau und Recycling von
Metaboliten in der Zelle dient. Einer dieser spezifischen Transporter ist LYAAT-1. Er
gehört zur AAAP (amino acid/auxin permease)-Familie, welche in Eukaryonten zuerst in
der Plasmamembran von Pflanzenzellen entdeckt wurde, wo sie eine Familie von
H + /Aminosäure-Symportern darstellt. Später wurde in Nervenzellen von Tieren ein
Vertreter dieser Familie beschrieben, welcher für die Aufnahme der inhibierenden
Aminosäuren und Aminosäurederivate Glycin und GABA mittels eines H + -Antiports in die
synaptischen Vesikel verantwortlich ist [45]. Er weist eine große Ähnlichkeit in den
funktionellen Charakteristika der Familie protonen-gekoppelter Aminosäuretransportern in
22

Plasmamembranen und synaptischen Vesikeln, in Lysosomen und in Neuronen des
Gehirns auf. LYAAT-1 schleust aktiv neutrale Aminosäuren und Aminosäure-Derivate
(Glycin, L-Ala und L-Pro und -Aminobuttersäure GABA; Km ~500 µM ) aus dem
Lysosom aus, wobei es chemiosmotisch an die H + -ATPase dieses Organells gekoppelt ist
[45]. LYAAT-1 vermittelt H + -Cotransport mit einer Stöchiometrie von 1 H + /1 Aminosäure
[58]. Untersuchungen zu Homologien im eukaryontischen Genom ergeben, dass LYAAT-1
zu einer Untergruppe von lysosomalen Transportern in der Aminosäure/Auxin-Permease
(AAAP) Familie zählt [45]. In C. elegans konnten sechs Proteine identifiziert werden, die
eine starke Homologie zu LYAAT-1 zeigen. Dazu zählen T27A1.5, welcher eine
Homologie von 91,3 % besitzt und Y43F4B.7 mit einer Homologie von 97,4 % zu
LYAAT-1 [66].
Abb. 12: Dendogramm der 13 Vertreter der AAAP-Familie in C. elegans und der vier
funktionell charakterisierten Vertreter aus dem Säugetier [45].
1.3.4 GCS-1 (γ-Glutamyl-Cystein Synthetase)
Alle Organismen müssen sich gegen reaktive Sauerstoffspezies (ROS) schützen, welche
während der mitochondrialen Respiration entstehen, oder aus exogenen Quellen stammen
[2]. Glutathion spielt eine wichtige Rolle beim Schutz gegen reaktive Sauerstoffspezies, im
Nährstoffmetabolismus und in der Regulation von zellulären Ereignissen, wie
Genexpression, DNA- und Proteinsynthese, Zellproliferation und Apoptose,
23

Signaltransduktion, Cytokinproduktion und Immunantwort. Ein Glutathionmangel trägt zu
oxidativem Stress bei, der an Alterungsprozessen und der Pathogenese vieler Krankheiten
beteiligt ist.
Glutathion fängt ROS und reaktive Intermediate ab. In Tierzellen ist das GSH/Glutathion-
Disulfid das wichtigste Redoxpaar. Die Synthese von GSH aus Glutamat, Cystein und
Glycin wird durch zwei cytosolische Enzyme, -Glutamyl-Cystein Synthetase und GSH
Synthetase, katalysiert. Dabei ist GCS (γ-Glutamyl-Cystein Synthetase) geschwindigkeits-
bestimmend in der Glutathionsynthese.
Abb. 13: Glutathionsynthese und dessen Nutzung in Tieren. Diese Enzyme katalysieren
die angezeigten Reaktionen (1) -Glutamyl-Cystein-Synthetase
(2) Glutathionsynthetase (3) Glutathion-abhängige Thioldisulfid oder Thioltransferase
oder nicht-enzymatische Reaktion (4) Glutathionreduktase (5) Glutathionperoxidase
(6) Superoxiddismutase (7) NAD(P)H Oxidase und mitochondriale respiratorische
Komplexe. Abkürzungen: GS-NO, Glutathion-Stickstoffoxid; LOO·, Lipidperoxylradikal;
LOOH, Lipidhydroperoxid; R·, Radikale; R, nicht-radikalisch; [59].
Im Säugetier stellt GCS ein Heterodimer bestehend aus einer katalytisch aktiven
Untereinheit (73 kDa) und einer regulatorischen Untereinheit (31 kDa) dar. Die
katalytische Untereinheit beinhaltet alle Substratbindungsstellen, wohingegen die
regulatorische Untereinheit die Affinität für Substrate und Inhibitoren bestimmt. Die Km
24

Werte der Säuger GCS für Glutamat und Cystein sind 1,7 und 0,15 mM, welche im
Bereich der intrazellulären Konzentrationen von Glutamat (2–4 mM) und Cystein (0,15–
0,25 mM) in der Rattenleber liegen [59].
1.3.5 NHX-2 (Na + /H + -Austauscher)
Na + /H + -Austauscher vermitteln den elektroneutralen Transfer von extrazellulärem Na + im
Austausch gegen intrazelluläres H + . Damit sind Na + /H + -Austauscher an der Regulation des
Zellvolumens, Flüssigkeitssekretion und -absorption und der pH-Homeostase beteiligt.
NHX-2 ist ein Na + /H + -Austauscher in C. elegans, wo er ausschließlich an der apikalen
Membran der intestinalen Epithelzellen exprimiert wird. Die Aktivität des
Oligotransporters PEP-2 steht in einer engen Verbindung mit dem von NHX-2 errichteten
intrazellulären pH-Wert. Dabei wird der Oligopeptidtransport von PEP-2, über einen
transmembranen Protonengradienten angetrieben. Durch die Ansäuerung in Folge der
Peptidaufnahme über PEP-2 wird NHX-2 aktiviert. Wird der Na + /H + -Austausch gehemmt,
führt dies zu einem Phänotypen, der dem Phänotyp bei einer kalorischen Restriktion
ähnelt. Die Behandlung der Würmer mit nhx-2 RNAi hatte eine Zunahme von 30-40 % in
der postreproduktiven Lebensspanne zur Folge. Darüber hinaus spielt NHX-2 auch eine
wichtige Rolle bei anderen Nahrungsaufnahmeprozessen. Dabei wird vermutet, dass der
Na + /H + -Austausch oder die intrazelluläre pH-Homöostase eine Vielzahl von Protonen-
gekoppelten Wegen zur Nahrungsaufnahme erleichtert [41].
1.4 Zielsetzung
Ziel dieser Arbeit war es zum einen festzustellen, über welche
Kompensationsmechanismen die fehlende Aufnahme von Peptiden, aufgrund des Verlustes
des PEP-2 Peptidtransporters, ausgeglichen werden kann. Dazu wurden die mRNA-
Expressionsmuster der Gene, die für die Komponenten verschiedener heteromerer
Aminosäuretransporter kodieren (aat-1, -2, -3, -4, -5, -6, -8, -9; atg-1, -2) und die mRNA-
Expressionsmuster der lysosomalen Aminosäuretransporterhomologe T27A1.5 und
Y43F4B.7 in C. elegans untersucht. Mit der Analyse der entsprechenden Gene in den
unterschiedlichen verwendeten Knockoutstämmen wurde beabsichtigt eventuelle
Zusammenhänge dieser Kompensationsmechanismen mit TOR bzw. dem DAF-
2/Insulin/IGF-ähnlichen Signaltransduktionsweg aufzuklären. Von diesen beiden Signal-
25

transduktionswegen ist bereits bekannt, dass sie einen Einfluss auf die PEP-2-Funktion
besitzen [35].
Zum anderen weisen die Würmer der Knockoutstämme pep-2 und pep-2;daf-2 eine
erhöhte Resistenz gegenüber oxidativen Stress auf. Dieses Phänomen sollte durch die
Untersuchung der mRNA-Expression des gcs-1 Gens näher beleuchtet werden. Es sollte
aufgeklärt werden, ob eine höhere mRNA-Expression dieses Gens, welches eine
Schlüsselrolle in der Glutathionneusynthese spielt, zu der erhöhten Resistenz führt. Des
weiteren ist bekannt, dass Lysosomen ebenfalls am Schutz der Zellen gegen oxidativen
Stress beteiligt sind. Das mRNA-Expressionsmuster der lysosmalen
Aminosäuretransporterhomologe T27A1.5 und Y43F4B.7 könnte auch hier einen Hinweis
geben, worauf die erhöhte Stressresistenz und die, in den pep-2;daf-2 Würmern
beobachtete Langlebigkeit, beruht.
Zusätzlich wurde untersucht, wie sich der Knockout von pep-2 auf die mRNA-Expression
von nhx-2 auswirkt. nhx-2 kodiert für einen Na + /H + -Austauscher, für den bereits eine
enge funktionelle Kopplung mit PEP-2 nachgewiesen werden konnte [41].
26

2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien
Tabelle 2: Chemikalienliste
Chemikalie Firma
Agar Agar SERVA high gel strength Serva, Heidelberg
Agarose NEEO Ultra Qualität ROTI ® GAROSE Roth, Karlsruhe
Ammoniumacetat Roth, Karlsruhe
Bacto Yeast Extract Sigma-Aldrich (Fluka), Steinheim
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich, Steinheim
Bromphenolblau Roth, Karlsruhe
Calciumchlorid Dihydrat (CaCl2 * 2 H2O) Roth, Karlsruhe
Chloroform Merck, Darmstadt
Cholesterin Sigma-Aldrich, Steinheim
Diethylpyrocarbonat (DEPC) Roth, Karlsruhe
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4 * 2 H2O) Roth, Karlsruhe
Dinucleotidtriphosphate (dNTP’s) Fermentas, St. Leon-Rot
EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) Roth, Karlsruhe
Eisessig Roth, Karlsruhe
Ethanol (EtOH) J.T. Baker, Devender
Ethidiumbromid 1% Roth, Karlsruhe
Formaldehyde Loading Dye Ambion ® , Austin, USA
Formaldehyd 37% Roth, Karlsruhe
Gelatine Sigma-Aldrich (Fluka), Steinheim
Gene Ruler TM DNA Ladder Mix Fermentas, St. Leon-Rot
Glycerin Roth, Karlsruhe
Hydrochlorid (HCl) Riedel-de Haën, Seelze
Isopropanol Roth, Karlsruhe
Kaliumhydroxid (KOH) Roth, Karlsruhe
Kaliumdihydrogenphosphat-Dihydrat (KH2PO4 * 2 H2O) Roth, Karlsruhe
Kaliumchlorid (KCl) Roth, Karlsruhe
Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4) Roth, Karlsruhe
LCM 10x: LC-Fast Start DNA Master SYBR ® Green I Roche Diagnostics, Mannheim
Magnesiumchlorid (MgCl2) für LightCycler ® (Stammlösung 25 Roche Diagnostics, Mannheim
mM)
Magnesiumchlorid (MgCl2) Roth, Karlsruhe
Magnesiumsulfat (MgSO4) Sigma-Aldrich, Steinheim
MMLV Reverse Transcriptase Rnase H Minus, Point Mutant Promega, Mannheim
5x MMLV Puffer Peomega, Mannheim
MOPS Roth, Karlsruhe
Natriumacetat Roth, Karlsruhe
Natriumchlorid (NaCl) J.T. Baker, Devender
Natriumhypochlorit (NaOCl) Roth, Karlsruhe
Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 * 2 H2O) Roth, Karlsruhe
Nonidet P40 (Ethylphenylpolyethylene glycol) USB Amersham life science,
Cleveland Ohio
Nystatin Sigma-Aldrich, Steinheim
PCR-H2O Roche Diagnostics, Mannheim
Pepton aus Casein, pankreatisch verdaut Sigma-Aldrich (Fluka), Steinheim
27

Proteinase K aus Triitirachium album Sigma-Aldrich (Fluka), Steinheim
Random Primers Fermentas, St. Leon-Rot
Ribonuclease Inhibitor Fermentas, St. Leon-Rot
Tris Roth, Karlsruhe
TRIZOL Invitrogen, Karlsruhe
Tween 20 Roth, Karlsruhe
2.1.2 Zusammensetzung der Medien, Medienzusätze,
Versuchspuffer und Arbeitslösungen
Cholesterin für NGM Agar:
0,5 g Cholesterin werden in 100 ml absolutem Ethanol gelöst.
Die Lösung wird bei –20°C gelagert.
Nystatin-Lösung für NGM-Agar:
Zunächst werden 4 g Nystatin-Pulver in einer 500 ml Schottflasche abgewogen. Dem
Pulver werden unter Rühren abwechselnd kleine Volumina der Lösungen A und B
hinzugegeben bis ein Endvolumen von 400 ml erreicht ist. Bei Lösung A handelt es sich
um 115,62 g Ammoniumacetat, welches nach und nach in dH2O bis zu einem Endvolumen
von 200 ml gelöst wird. Lösung B bezeichnet 200 ml unvergällten 96%iges Ethanol. Das
Nystatin wird vollständig durch Erwärmen auf 55°C gelöst. Die Lösung wird sterilfiltriert
und kann bei -20°C gelagert werden.
1 M Kaliumphosphatpuffer für NGM Agar:
108,53 g KH2PO4
35,28 g K2HPO4
werden in 1 l Millipore H2O gelöst, autoklaviert und mit KOH wird ein pH von 6,0
eingestellt.
28

NGM (Nematode-Growth-Medium)-Agar:
17,0 g Agar Agar SERVA high gel strength
3,0 g NaCl
2,5 g Pepton aus Casein, pankreatisch verdaut
werden in 1 l Millipore H2O gelöst und autoklaviert. Nach dem Autoklavieren und
Abkühlen auf 55°C bis 60°C erfolgt die Zugabe von:
0,5 ml 1M CaCl2
1,0 ml Cholesterin
25,0 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer pH 6,0
1,0 ml 1M MgSO4
10,0 ml Nystatin-Lösung
Der Agar wird gut durchmischt und in Zellkulturschalen gegossen, über Nacht bei
Raumtemperatur belassen, damit sich der Agar verfestigen kann und anschließend bei 4°C
gelagert.
DYT-Medium:
16 g Pepton aus Casein, pankreatisch verdaut
10 g Bacto Yeast Extract
5 g NaCl
werden in 1 l Millipore H2O gelöst, autoklaviert und evtl. in sterile 100 ml Schottflaschen
umgefüllt und nochmals autoklaviert. Die Lagerung erfolgt bei 4°C.
M9-Puffer:
3,0 g KH2PO4
6,4 g Na2HPO4 * 2 H2O
5,0 g NaCl
in 1 l Millipore H2O lösen und autoklavieren. Abschließend 1 ml 1M MgSO4 zugeben.
Bleach-Lösung:
0,5 ml Natriumhypochlorit (NaOCl)
1,25 ml 5 M Kaliumhydroxid (KOH)
ad 25 ml Millipore H2O
29

2x Worm Lysis Buffer (2x WLB):
100 µl 1 M KCl
100 µl 1 M Tris pH 8,0
100 µl 50 mM MgCl2
15 µl Nonidet P40
15 µl Tween 20
1 ml 0,1% Gelatine
10x Taq-Puffer:
500 mM KCl
100 mM Tris HCl pH 8,3
0,25% Tween 20
0,25% Nonidet P40
0,25 mg/ml BSA
20 mM MgCl2
sterilfiltrieren.
50x TAE:
242 g Tris
57,1 ml Eisessig
100 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0)
werden gelöst und autoklaviert.
Arbeitslösung der Primer für PCR-Amplifikationen zur Identifizierung des
Mutanten Allels pep-2(lg601):
Eine Primer-Konzentration von 100 pmol/µl wird für die Standard-PCR eingesetzt, dazu
wird zum Lyophilisat das im Beipackzettel von MWG angegebene Volumen an Aqua
bidest. hinzupipettiert und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die
Lösung gevortext und zentrifugiert.
30

10x Probenpuffer für DNA-Gele:
10x TAE
50% Glycerin
0,02% Bromphenolblau
Stocklösung der Primer für die LightCycler ® Amplifikationen:
Um eine Primer-Konzentration von 100 pmol/µl zu erhalten, wird zum Lyophilisat das im
Beipackzettel von MWG angegebene Volumen an 1 mM Tris pH 7,5 in Aqua bidest.
hinzupipettiert und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die Lösung
gevortext und zentrifugiert.
Arbeitslösung der Primer für die LightCycler ® Amplifikationen:
Die Arbeitslösung der in der LightCycler Real-time PCR eingesetzten Primerlösung soll 20
pM betragen. Dazu wird die Stocklösung in Aqua bidest. verdünnt.
2.1.3 Geräte
Tabelle 3: Geräteliste
Gerät Firma
Agarosegelelektrophoreselaufkammern PEQLAB Biotechnologie, Erlangen
BioPhotometer Eppendorf, Hamburg
Falkons 15 ml Greiner Bio-One, Frickenhausen
Falkons 50 ml Greiner Bio-One, Frickenhausen
Mikroskop Leica MZ 16 FA Leica, Bensheim
Mikroskop Leica MZ 75 Leica, Bensheim
LightCycler ®
31
Roche Diagnostics, Mannheim
LightCycler ® Capillaries Roche Diagnostics, Mannheim
LightCycler ® Software Version 3.5 Roche Diagnostics, Mannheim
PCR Express Thermal Cycler Hybaid, Middlesex, UK
Tischzentrifuge A14 Jouan, Unterhaching
Zellkulturschalen rund 6 cm Greiner, Frickenhausen
Zellkulturschalen rund 9 cm Sarstedt, Nümbrecht
Zentrifuge B4i Jouan, Unterhaching

2.1.4 Informationen zu den untersuchten C. elegans Stämmen
Für die Untersuchungen in dieser Arbeit wurden die C. elegans Stämme N2 var. Bristol,
BR2742, BR2688 und BR3061 verwendet. Die Stämme wurden vom Caenorhabditis
elegans Genetics Center zur Verfügung gestellt.
2.1.4.1 N2
Der Stamm N2 var. Bristol stellt den Wildtypstamm der Nematoden dar. Dieser
Wurmstamm wird in 1.1 genauer beschrieben.
2.1.4.2 BR2742
Der Wurmstamm BR2742 besitzt eine 1,7 kb Deletion im Gen pep-2. Bei dem
Deletionsallel handelt es sich um pep-2(lg601)X. Hier fehlen die ersten sechs Exons des
pep-2 Gens, das Translationsstartcodon und 257 bp des Promoters. Somit ergibt sich ein
Nullallel, welches zum vollständigen Verlust der PEP-2 Funktion führt. In diesem
Wurmstamm beobachtet man eine verzögerte Embryonalentwicklung (um etwa 75%
verzögert), eine Verringerung der Nachkommenzahl (1/3 des Wildtyps) und eine geringere
Körperlänge [35].
2.1.4.3 BR2688
Der Wurmstamm BR2688 weist einen Doppelknockout zum einen des pep-2(lg601)X
Allels und zum anderen des daf-2(e1370)III Allels auf [25]. Diese Würmer sind sehr
langlebig, besitzen ein um mehr als das doppelt so lange Embryonalentwicklung und nur
ca. 15 % der Wildtypnachkommenzahl [35].
2.1.4.4 BR3061
Bei den Würmern des Stammes BR3061 handelt es sich um Dreifachmutanten. Ihnen
fehlen die Allele pep-2(lg601)X, daf-2(e1370)III und daf-16(m26). Sie zeichnen sich durch
32

eine um 86 % gegenüber dem Wildtyp verzögerte Embryonalentwicklung und eine
geringere Nachkommenzahl von 1/3 der Wildtypnachkommenzahl aus [35].
2.1.5 Informationen zu den verwendeten Primerpaaren
2.1.5.1 Primer für die LightCycler ® Amplifikationen
Tabelle 4: Informationen zu den Primern der Zielgene
Gen Primer-Name Primer Sequenz T m
[°C]
33
Position Länge
[bp]
aat-1 aat-1_for_RT GCAAGAACAAGCCGGATC 56.0 171-188 18
aat-1_rev_RT TGGTCGGACTACGATAGC 56.0 355-372 18
aat-2 aat-2_for_RT AGCTCGGGACACTAATC 52.0 269-284 17
aat-2_rev_RT TGCTACATCGGGCATCA 52.0 586-602 17
aat-3 aat-3_for_RT GAGGAGCCATCCTTGC 59.5 1178-1193 16
aat-3_rev_RT CGTGACGGAATCTGTG 59.8 1416-1431 16
aat-4 aat-4_for_RT ACTGGTAGTAGTGCCTTT 59.4 1202-1220 18
aat-4_rev_RT GGCAACTGCTTCGTAAT 59.5 1523-1539 17
aat-5 aat-5_for_RT TGCCTGCCAGATGTCA 59.6 1477-1492 16
aat-5_rev_RT CACACTGGAGATTAGCATTT 59.8 1643-1662 20
aat-6 aat-6_for_RT TCGGTCGGCTTATCAC 50.0 151-165 16
aat-6_rev_RT TCGCAAGTGAGGCAAG 50.0 514-529 16
aat-8 aat-8_for_RT TGACAACGACAGTCCG 59.9 1121-1137 16
aat-8_rev_RT ACAACAACACCGCCTA 59.7 1418-1433 16
aat-9 aat-9_for_RT ATACTGAGAGCCTAATCACC 60.0 1102-1121 20
aat-9_rev_RT CCATCAAAACCAGTCCG 60.0 1317-1333 17
ama-1 ama-1_for_RT GTGCCGAGACAACTCATC 54.0 1531-1548 18
ama-1_rev_RT GAGTCTGGATGGGTACTG 56.0 1788-1805 18
atg-1 atg-1_for_RT CTTTGACAAGACCGCC 50.0 75-90 16
atg-1_rev_RT GTGACTCCGATCTTCC 50.0 401-416 16
atg-2 atg-2_for_RT ACATCAGCCATCAGTCC 52.0 1510-1526 17
atg-2_rev_RT GGCGGTGACTATTGTAG 52.0 1823-1839 17
gcs-1 gcs-1_for_RT GTAGTCCGTTGACGTGG 60.2 20-36 17
gcs-1_rev_RT ACCTCCGTAAGGCATTC 60.0 329-345 17
nhx-2 nhx-2_for_RT CGGATTCCGCGTTACT 60.6 230-245 16
nhx-2_rev_RT GCCCATAAGGAGAGAGCAA 60.7 458-476 19
T27A1.5 T27A1.5_for_RT TGGATTCGCGGACACG 61.7 364-379 16
T27A1.5_rev_RT GTCAGAGAAAAGGTCTGCC 61.7 639-657 19
Y43F4B.7 Y43F4B.7_for_RT GACTTGTGCAATAGCTGAG 60.1 1125-1143 19
Y43F4B.7_rev_RT AGGTTCCCGTTGTGAATC 60.1 1313-1330 18
Produktlänge
[bp]
Annealingtemperatur
für die LC-
Amplifikation
[°C]
201 62
333 62
253 62
337 62
185 62
378 62
312 62
231 62
275 62
341 62
329 62
325 62
247 60
294 60
206 60

2.1.5.2 Primer für PCR-Amplifikationen zur Identifizierung des
Mutantenallels pep-2(lg601)
Tabelle 5: Informationen zu den Primern für die Identifizierung des Mutanten Allels pep-
2(lg601).
Primer-Name Primer-Sequenz Tm [°C] Position Länge
[bp]
Produkt länge
[kb]
pep-2_for1 GCAACACACTGTACGGAAC 56.7 siehe Graphik 19 wt: 2.1
pep-2_rev1 CCAGTGGGTGCACCACAAGG 63.5 siehe Graphik 20 pep-2: 0.5
pep-2_ko_for AAAAATTTGCAGCGGTCTTG 53.2 siehe Graphik 20 wt: 0.4
pep-2_ko_rev GTTGCCACGGTTGAAGTTCT 57.3 siehe Graphik 20 pep-2: k. Produkt
Abb. 14: Lokalisierung und Bestätigung der pep-2(lg601) Deletion in homozygoten
Tieren mittels PCR [34].
Um die Deletion von pep-2(lg601) nachzuweisen, wird eine Single-Worm-PCR (SW-PCR)
mit pep-2 spezifischen Primern durchgeführt. Das Primerpaar 1 lagert sich außerhalb der
deletion an, wodurch ein Wildtypfragment (2,1 kb) und ein pep-2 Deletionsfragment (0,5
kb) entsteht (siehe Abb. 14 PCR 1). Die Homozygotie der Deletion kann mit Hilfe des
Primerpaares 2 ermittelt werden, welches innerhalb der Deletion lokalisiert ist und für den
Wildtyp ein 0,4 kb Fragment liefert, während ein homozygoter pep-2 Knockout keine
Bande ergibt (siehe Abb. 14 PCR 2) [34].
34

2.2 Methoden
2.2.1 Aufzucht von C. elegans
Die Aufzucht von C. elegans erfolgt auf runden Petrischalen mit einem Durchmesser von 6
cm. Diese sind mit NGM-Agar gefüllt, auf dem als Futterquelle für die Würmer ein Rasen
aus Escherichia coli Bakterien vom Stamm OP50 hochgezüchtet wurde. Die Würmer
werden bei 20°C gehalten. Um die Würmer auf frische Platten mit ausreichend Nahrung
umzusetzen, werden jeweils fünf Würmer, die sich im L4 Larvenstadium befinden, mit der
plattgedrückten Spitze eines Platindrahtes, der an einer Pasteurpipette befestigt wurde,
aufgenommen und auf eine frische Platte gesetzt.
Benötigt man für einen Versuch eine sehr große Menge an Würmern, können ganze Stücke
einer überwachsenen 6 cm-Platte mit einem Skalpell ausgeschnitten werden und auf 9 cm-
Platten gesetzt werden. Diese Agarstücke werden am nächsten Tag wieder entfernt, so dass
möglichst viele Würmer herunterkriechen können. Eine Platte ist dann überwachsen, wenn
kein Futter mehr vorhanden ist und dadurch hauptsächlich L1 Larven vorhanden sind, die
sich ohne Futter nicht mehr weiter entwickeln.
2.2.2 Synchronisieren der Würmer (Egg Prep)
Für manche Versuche kann es sinnvoll sein synchronisierte Würmer zu verwenden, d.h.
alle Würmer befinden sich in einem Stadium. Um dies zu erreichen, werden die Eier durch
Aufbrechen erwachsener Würmer gewonnen. Aus den Eiern schlüpfen über Nacht L1
Larven, die sich dann synchron weiterentwickeln. Je nach Versuchsgröße werden mehrere
9 cm-Platten, welche eine gemischte Wurmkultur enthalten, die viele Erwachsene Würmer
aufweist, zweimal mit jeweils ca. 2 ml M9-Puffer abgespült. Dazu verwendet man eine
Glaspasteurpipette, da die Würmer an Plastikpipettenspitzen haften bleiben. Die Würmer
werden in 15 ml Falkons gesammelt und anschließend für 3 min bei 2500 rpm
zentrifugiert. Der Überstand wird auf 1-2 ml abgesaugt. Das Wurmpellet wird zweimal mit
je 9 ml M9-Puffer gewaschen. Nach dem letzten Mal Waschen, wird der Überstand auf
3 ml abgesaugt. Nun werden 3 ml der Bleach-Lösung zu den 3 ml Wurmsuspension
hinzugegeben und sofort sehr kräftig 3-4 min lang geschüttelt. Der Zustand der Würmer
wird unter dem Mikroskop kontrolliert. Wenn alle Würmer nach den 3-4 min tot sind,
35

werden die 6 ml Wurm-Bleach-Gemisch auf vier 1,5 ml Eppendorfgefäße aufgeteilt und
für 2 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und wieder auf 1,5 ml
mit M9-Puffer aufgefüllt und erneut zentrifugiert. Nachdem der Überstand abgenommen
wurde, wird der Inhalt der vier Eppendorfgefäße auf nur noch zwei vereinigt.
Anschließend wird mit M9-Puffer wieder auf 1,5 ml aufgefüllt und zentrifugiert. Nun
folgen 5-10 Waschschritte mit M9-Puffer, bis kaum noch Chlorgeruch wahrgenommen
werden kann. Nach dem letzten Waschschritt wird der Inhalt der beiden Eppendorfgefäße
in ein 15 ml Falkon überführt, wobei jedes Eppendorfgefäß 3x mit M9 nachgespült wird.
Damit den Würmern ausreichend Sauerstoff zur Verfügung steht, wird mit M9-Puffer auf
etwa 6-8 ml aufgefüllt. Je nach Wurmmenge kann es auch sein, dass man die
Wurmsuspension auf mehrere Falkons aufteilen muss. Unter dem Mikroskop sollten Eier
erkennbar sein. Damit daraus L1 Larven schlüpfen können, lässt man das Falkon
anschließend über Nacht bei 15 °C rotieren. Solange kein Futter vorhanden ist, entwickeln
sich die L1 Larven nicht weiter.
Am folgenden Tag werden die Larven 1-2 mal mit M9-Puffer gewaschen. Um
Zelltrümmer von den L1 Larven zu trennen, wird das Falkon aufrecht hingestellt. Dabei
sinken die Zelltrümmer schneller ab als die L1 Larven. Deshalb wird der Überstand in ein
frisches Falkon überführt.
2.2.3 Gewinnung des Wurmmaterials für die RNA-Präparation
Im nachfolgenden Versuch soll staged RNA verwendet werden, d.h. die RNA stammt aus
einem Larvenstadium. Wir haben drei Larvenstadien untersucht, dabei handelt es sich um
die Larvenstadien L2, L3 und L4. Man beginnt für jeden Stamm mit drei 9 cm-Platten,
welche mit einer gemischten Kultur überwachsen ist. Diese drei Platten werden auf 20x 9
cm Platten verteilt. Man lässt die Würmer solange wachsen, bis genügend adulte Würmer
für eine Egg-Prep vorhanden sind. Je nach Stamm können sich hier Unterschiede in der
benötigten Entwicklungszeit ergeben. Im Anschluss an die Egg Prep werden die Würmer
unter dem Mikroskop ausgezählt und 3000-4000 Würmer je 9 cm-Platte auf 10 dieser
Platten gegeben. Erneut wartet man bis die Würmer für eine Egg Prep ausreichend weit
entwickelt sind. Nach der 2. Egg Prep werden alle L1 Larven auf 30x 9 cm-Platten verteilt.
Dabei werden je 10 Platten für ein Larvenstadium benötigt. Aufgrund der
unterschiedlichen Entwicklungsdauer ist es sinnvoll die L1 Larven nicht immer zur
gleichen Zeit auf die Platten zu verteilen. Hier sollte man sich einen Zeitplan erstellen, der
36

auf die Entwicklungszeit für die einzelnen Stämme und Larven-Stadien abgestimmt ist.
Um Wildtyp L2 Larven zu erhalten, werden die Würmer nach 18 Stunden von den Platten
gespült. Für L3 Larven benötigt man 30 Stunden und für L4 Larven 42 Stunden bis sie sich
etwa in der Mitte des gewünschten Entwicklungsstadiums befinden. Diese Angaben
beziehen sich jedoch nur auf den Wildtyp-Stamm N2. Wie erwähnt gelten für andere
Stämme andere Zeiten. Haben die Würmer das gewünschte Stadium erreicht, werden sie
mit M9-Puffer, wie für eine Egg Prep von den Platten gespült. Anschließend werden die
Würmer 1-2 mal mit M9 Puffer gewaschen. Der Überstand wird nun auf 400 µl
abgenommen und das Wurmpellet darin resuspendiert und in flüssigem Stickstoff
eingefroren. Die Würmer werden bei –80°C gelagert. Grundsätzlich sollte darauf geachtet
werden, dass Wurmüberreste möglichst gut von den L1 Larven getrennt werden, bevor
diese auf die Platten gegeben werden. Außerdem sollte sichergestellt werden, dass den
Würmern während der Kultur genügend Futter zur Verfügung steht.
2.2.4 Auszählen der L1 Larven nach der Egg Prep
Um abschätzen zu können welches Volumen auf die 9 cm Platten aufgebracht wird, damit
man 3000-4000 Würmer pro Platte erhält, muss zunächst die Anzahl der L1 Würmer
ermittelt werden. Dazu werden aus dem 15 ml Falkon fünfmal 5 µl Wurmsuspension auf
einen Objektträger pipettiert, wobei darauf geachtet werden muss, dass die
Wurmsuspension gut durchmischt wird. In jedem der fünf Tropfen werden die L1 Larven
unter dem Mikroskop ausgezählt und anschließend der Mittelwert pro µl bestimmt.
2.2.5 RNA Präparation
Zunächst wird das Wurmmaterial zu feinem Pulver zerrieben. Dazu fasst man das im
flüssigen Stickstoff eingefrorene 15 ml-Falkon nur an der Spitze unten an, damit die Probe
antaucht. Dabei klopft man das Falkon mehrmals mit dem Deckel auf den Tisch bis sich
die Probe abgelöst hat. Nun gibt man das gefrorene Wurmmaterial in eine zuvor mit
flüssigem Stickstoff vorgekühlte, sterile Mörseschale. Das Wurmmaterial wird mit einem
ebenfalls vorgekühlten und sterilen Pistel zu feinem Pulver zerrieben. Anschließend gibt
man 2 ml TRIZOL zu dem Pulver, so dass möglichst die gesamte Probe benetzt ist. Diese
Mischung lässt man langsam auftauen. Das Homogenisat muss danach gut durchmischt
werden. Im Anschluss wird das Homogenisat auf vier RNAse-freie 1,5 ml
37

Eppendorfgefäße aufgeteilt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, um die
Nukleoproteine von den Nukleinsäuren zu trennen. Nach Zugabe von 1/5 des
Anfangsvolumens an Chloroform werden die vier Proben etwa 20 s gevortext und erneut
bei Raumtemperatur für 10 min inkubiert. Das Chloroform sollte keine Zusätze wie
Isoamylalkohol beinhalten. Im Folgenden werden die Proben bei 13000 rpm für 15 min
zentrifugiert, wobei drei Phasen entstehen, eine farblose, wässrige obere Phase, welche die
RNA enthält, eine semi-solide Interphase, die hauptsächlich DNA enthält und eine untere
organische Phase. Die obere wässrige Phase wird vorsichtig in vier neue RNAse-freie
1,5 ml Eppendorfgefäße überführt, dabei sollten Verunreinigungen durch DNA vermieden
werden. Der wässrigen Phase wird zuerst die Hälfte des Anfangsvolumen zugefügt, gut
gemischt und als nächstes ein Anfangsvolumen Isopropanol hinzupipettiert, wieder gut
gemischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation erfolgt ein
Zentrifugationsschritt von 15 min bei 13000 rpm, um die RNA zu pelletieren. Der
Überstand wird vorsichtig abgenommen und die Pellets mit einem Anfangsvolumen kalten
75 %igen Ethanol bei 13000 rpm für 5 min gewaschen. Das Ethanol wird vorsichtig mit
einer Pipette abgenommen und die Pellets ca. 10 min an der Luft getrocknet. Anschließend
werden alle Pellets in insgesamt 30 µl DEPC-H2O aufgenommen und die RNA bei –80°C
gelagert.
2.2.6 Bestimmung der RNA-Konzentration
Zur Bestimmung der RNA-Konzentration wird die RNA zunächst auf Eis aufgetaut, durch
Anschnippen gemischt, anzentrifugiert und 1 µl der in DEPC-H2O gelösten RNA zu 99 µl
Aqua bidest. pipettiert. Die Messung erfolgt am BioPhotometer bei 260 nm mit den
Einstellungen zur Messung von RNA und der entsprechenden Verdünnung. Vor der
Messung wird die Probe nochmals gut durchmischt. Die Probe wird in mindestens drei
verschiedenen Verdünnungen gemessen, dazu werden jeweils 100 µl Aqua bidest. in die
Quarz-Küvette gegeben und erneut gut durchmischt. Es ist ratsam bei hohen
Ausgangskonzentration zuvor noch eine Verdünnung mit DEPC-H2O vorzunehmen.
2.2.7 RNA-Kontrollgel
Bevor mit der cDNA-Synthese begonnen werden kann, muss die RNA daraufhin geprüft
werden, ob sie nicht während der Extraktion abgebaut wurde. Dazu wird ein RNA-Gel
38

enötigt, das wie folgt hergestellt wird. Man wiegt 0,8 g RNA-Agarose in einen sterilen
Erlenmeyer-Kolben und kocht diese zusammen mit 65,5 ml DEPC-H2O auf. Die nächsten
Schritte sind unter dem Abzug durchzuführen. Zunächst lässt man die Agarose noch etwas
abkühlen, dann fügt man zügig 6,6 ml 37 %iges Formaldehyd und 8 ml 10x MOPS hinzu,
mischt das Ganze und gießt es direkt in der Agarosegellaufkammer, welche zuvor mit
70 %igem Ethanol gereinigt wird.
Als Laufpuffer verwendet man ca. 500 ml in 1x MOPS in DEPC-H2O. Aufgetragen wird
1 µg RNA. Diese wird zusammen mit dem 3-fachen Volumen an Formaldehyde Loading
Dye, welcher 1 % Ethidiumbromid enthält, 5 min bei 75°C denaturiert, abzentrifugiert und
anschließend 1 min auf Eis belassen. Die Probe wird dann auf das Gel aufgetragen. Der
Gellauf erfolgt bei 80 V für 1 ½ bis 2 h.
2.2.8 Lightcycler real-time RT-PCR
2.2.8.1 cDNA Synthese
Für die Reverse Transkriptase-Reaktion benötigt man ein RNA Template, einen Primer
(Random- oder Oligonukleotidprimer), dNTP’s, Puffer und eine Reverse Transkriptase
[62]. Bei der Reversen Transkriptase handelt es sich um ein Enzym, das einen
vorhandenen RNA-Strang als Matrize verwendet und diese in DNA umschreibt. Das
Enzym kommt in Retroviren, z. B. HI-Viren vor, deren Genom aus RNA besteht. Um das
eigene Genom in das Wirtsgenom einbauen zu können, muss die virale RNA zunächst mit
Hilfe der Reverse Transkriptase in DNA umgeschrieben werden [63].
Die cDNA-Synthese erfolgt mit 0,5 µg Gesamt-RNA, wodurch man eine cDNA-
Konzentration von 12,5 ng/µl in der Probe erhält. Der erste Mastermix besteht aus 8 µl 5x
MMLV Puffer (Endkonzentration 3 mM MgCl2), 6µl dNTP’s (300 µM) und einer
entsprechenden Menge PCR-H2O, um zusammen mit dem benötigten Volumen an RNA
ein Endvolumen von 30 µl pro Reaktionsgefäß zu erreichen. Dabei sollte beachtet werden,
dass sowohl der erste als auch der zweite Mastermix für eine um 1 bis 2 Proben höher
Probenanzahl zusammenpipettiert wird. Die Reagenzien werden auf Eis aufgetaut, gut
gemischt, anzentrifugiert und zusammenpipettiert. Bevor die Proben für 5 min bei 65°C
inkubiert werden, werden sie nochmals gemischt und zentrifugiert. Anschließend werden
den Proben 10 µl des zweiten Mastermixes hinzupipettiert. Dieser besteht aus 0,4 µl
39

Random Hexamers (0,5 µg/µl), 0,31 µl RNAse-Inhibitor (40 U/µl), 1µl MMLV Reverse
Transcriptase Rnase H Minus, Point Mutant (200 U/µl) und 8,29 µl PCR-H2O pro Probe.
Nach Zugabe des zweiten Mastermixes werden die Proben für 1 h bei 37°C und 1 min bei
99°C inkubiert. Auch hier ist es wichtig den Mastermix und die Proben zuvor gut zu
mischen. Es ist sinnvoll als Qualitäts-Kontrolle für die vorherige RNA-Extraktion eine
Probe mitzuführen, der kein Enzym zugesetzt wurde (O-Kontroll-Probe). Dadurch lassen
sich eventuelle Verunreinigungen der Proben mit DNA in den späteren LightCycler ®
Amplifikationen nachweisen. Die cDNA wird bis zur Verwendung bei –80°C gelagert.
2.2.8.2 Lightcycler-Amplifikation
Die real-time RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction) ist eine sehr
empfindliche Technik, um mRNA zu detektieren und zu quantifizieren. Darüber hinaus
stellt die real-time RT-PCR ein wichtiges Werkzeug für die Klonierung, die Erstellung von
cDNA-Bibliotheken, die Synthese von Sonden, Differential Display und für die
Signalverstärkung bei in situ Hybridisierungen dar. Die Technik der real-time RT-PCR
setzt sich aus zwei Stufen zusammen: zunächst muss die cDNA aus der mRNA durch die
Reverse Transkription (RT) gewonnen werden und anschließend kann diese cDNA in einer
spezifischen Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert werden. Die Detektion der
Amplifikationsprodukte erfolgt in Echtzeit, was dieser Technik ihren Namen gab.
Die Polymerasekettenreaktion besteht im wesentlichen aus drei Stufen, die für 30-50
Zyklen wiederholt werden:
1. Denaturierung: Hier wird der Reaktionsansatz auf ca. 95°C erhitzt, um die
Trennung der doppelsträngigen DNA zu bewirken, damit der nächste Schritt
erfolgen kann.
2. Annealing: In diesem Schritt wird die Temperatur wieder erniedrigt (ca.55-60°C,
primerabhängig). Nun lagern sich die einzelsträngigen Primer an die
einzelsträngige DNA an. Primer, die an komplementären Sequenzen gebunden
haben, bleiben dort gebunden, so dass an diesem Stück doppelsträngiger DNA die
DNA-Polymerase ansetzen kann und die DNA komplementär vervollständigen
kann. Dies geschieht im nächsten Schritt.
40

3. DNA-Synthese: Die DNA-Polymerase verknüpft die dNTP’s bei einer Temperatur
von ca. 70°C mit dem Primer und der Matrize und bildet dadurch einen neuen
doppelsträngigen DNA-Strang. Anschließend beginnt ein neuer Zyklus.
Abb. 15: Die drei Schritte der Polymeras-Kettenreaktion [61].
Da beide Stränge gleichzeitig während der PCR komplementär vervollständigt werden,
kommt es unter Idealbedingungen zu einer exponentiellen Zunahme der Anzahl an Kopien
des Gens [61].
Abb. 16: Darstellung der unter Idealbedingungen ablaufende exponentiellen Zunahme der
Kopienzahl [61].
41

Die real-time RT-PCR-Reaktion wird häufig für die Quantifizierung physiologisch
bedeutender Änderungen in der Genexpression eingesetzt [67]. Die Verwendung eines
LightCyclers ® (Roche) zusammen mit dem Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen (SYBR ®
Green I) ermöglichen eine sehr empfindliche und schnelle Erfassung dieser Änderungen
[37].
Der Fluoreszenzfarbstoff SYBR ® Green I bindet an der kleinen Furche der DNA
Doppelhelix. Befindet sich der Farbstoff frei in der Lösung, kommt es nur zu einer sehr
geringen Fluoreszenz, jedoch erhöht sich die Fluoreszenz sehr stark, wenn der Farbstoff
die DNA bindet. Folgende Abbildungen sollen das Prinzip verdeutlichen:
A B
C
Abb. 17: Prinzip der SYBR Green Technik. (A) Zu Beginn der Amplifikation beinhaltet
das Reaktionsgemisch hauptsächlich denaturierte DNA, an die der Farbstoff nicht bindet
und dieser somit nur frei in der Lösung vorliegt. Die geringe Fluoreszenz der freien
Farbstoffmoleküle verursachen nur ein sehr schwaches Hintergrund-Fluoreszenzsignal. (B)
Durch die Anlagerung der Primer, binden einige Farbstoffmoleküle an den
doppelsträngigen DNA-Strang. Nach Anregung ist eine starke Zunahme der emittierten
Fluoreszenz der SYBR ® Green I Moleküle zu beobachten. (C) Während der Elongation
kommt es immer häufiger zur Anlagerung der Fluoreszenz-farbstoffmoleküle an die neu
synthetisierte DNA. Die Emission des Lichtes ist dabei proportional zur Anzahl der neu
gebildeten DNA-Stränge [64].
42

Als erstes wird die cDNA auf Eis aufgetaut. Dem folgt eine Denaturierung der cDNA für 5
min bei 65°C. Der nächste Schritt besteht darin den Mastermix herzustellen. Dieser besteht
aus 6,4 µl PCR-H2O, 1,2 µl 25 mM MgCl2, 0,2 µl 20 µM Forward Primer, 0,2 µl 20 µM
Reverse Primer und 1 µl LCM 10x: LC-Fast Start DNA Master SYBR ® Green I pro Probe,
wobei auch hier der Mastermix für eine um eine Probe höhere Probenanzahl hergestellt
wird. Der Mastermix wird gut gemischt und jeweils 9 µl in die Kapillaren vorgelegt.
Anschließend wird je 1 µl (12,5 ng) der zuvor gut gemischten cDNA in die Kapillaren
pipettiert und diese verschlossen. Die gesamten Vorbereitungen erfolgen in einem
Kühlblock. Nun werden die Proben kurz (~20s) bei max. 3000 rpm abzentrifugiert und in
den Kapillarenständer eingesetzt. Der Kapillarenständer wird in den LightCycler ® gestellt.
Nach Auswahl des entsprechenden Programms (siehe Tabelle unten), wird die
Amplifikation gestartet. Als Kontrolle sollte immer eine Probe ohne cDNA mitgeführt
werden. Dadurch kann man auf Verunreinigungen der Reagenzien schließen. Des weiteren
wird für jedes Primerpaar einmal eine O-Kontroll-Probe mitgemessen. Außerdem werden
alle Messungen bis auf die Kontrollen in einer Doppelbestimmung durchgeführt. Als
interne Kontrolle wurde für jede Probe das Gen ama-1 in einer Doppelbestimmung
gemessen.
Tabelle 6: Programm für die Lightcycler Amplifikation
Cycle Type Segment 1-4)
43
Target Temp
Time
Files: Denat. 1 Regular 1) 95°C 600 20
Ampl. 40 Quantification 1) 95°C
2) 60°C bzw. 62 °C
3) 72°C
4) 79°C
Melt 1 Melting Curve 1) 95°C
2) 60°C
3) 99°C
Cool 1 Regular 1) 40°C 60 20
sec
15
10
20
5
0
10
0
Rate
20
20
20
20
20
20
0.10

2.2.9 Primerdesign
Die unter Punkt 2.1.5.1 aufgeführten Primer wurden mit der LightCycler ® Probe Design
Software designed. Dazu wird in der National Libary of Medicine (Pubmed) [65] und in
der Wormbase [66] nach den entsprechenden CDS bzw. mRNA-Sequenzen gesucht,
welche in das Programm eingegeben werden. Die Auswahl geeigneter Primerpaare richtet
sich dabei nach der Schmelztemperatur Tm, die für die zusammengehörenden Primer
möglichst gleich sein sollte, nach der Spezifität für das zu amplifizierende Gen, nach der
möglichst geringen Ausbildung von Primerdimeren oder Hairpins und nach der Lage von
mindestens einem der beiden Primer eines Paares auf einer Exon-Intron-Grenze.
2.2.10 Primeretablierung
Ein Primeretablierung ist nötig, um die geeignetste Annealingtemperatur des jeweiligen
Primerpaares zu ermitteln, bei der zum einen das gewünschte Produkt gebildet wird und
zum anderen keine Primerdimer und Hairpins entstehen. Zunächst wird eine Lightcycler
Amplifikation durchgeführt, deren Qualität im Anschluss durch eine Agarose-
gelelektrophorese überprüft wird.
2.2.10.1 Lightcycler-Amplifikation
Die Lightcycler-Amplifikation wird entsprechend dem Protokoll unter Punkt 2.2.8.2
durchgeführt, wobei jedoch der Mastermix bereits Kontroll-cDNA enthält. Es werden
9,6 µl Mastermix in die Kapillaren vorgelegten und je 0,2 µl der Primer hinzupipettiert.
2.2.10.2 Agarosegelelektrophorese
Zur Überprüfung der Qualität der Lightcycler-Amplifikation und der Primerspezifität,
werden die Kapillaren überkopf in 1,5 ml Eppendorfgefäße gestellt, in welche 2 µl 10x
Probenpuffer vorgelegt werden. Die Kapillaren werden dann kurz anzentrifugiert, um den
Inhalt der Kapillaren in den 1,5 ml Eppendorfgefäßen zu sammeln. Diese Proben mit
einem Volumen von ca. 12 µl können nun zusammen mit 5 µl Längenstandard Gene
Ruler TM DNA Ladder Mix auf ein 1,5-2 %iges Agarosegel aufgetragen werden. Als
44

Laufpuffer dient 1x TAE. Der Lauf dauert bei 80 V etwa 1 bis 1 ½ h. Unter UV-Licht kann
man nun überprüfen, ob das gebildete Produkt die richtige Größe besitzt und ob eventuell
zusätzliche Banden von Primerdimeren oder Produkten, die durch unspezifische
Primeranlagerung entstehen, zu erkennen sind.
2.2.10.3 Auswertung der PCR-Amplifikationen und Datenanalyse
Im Programm des LightCyclers ® wurden die Crossing-Points über die „Second Derivation
Maximum― Methode ermittelt [43]. Die Schmelzkurve ließ eine Beurteilung der Qualität
der Amplifikation und das Vorhandensein eventueller Verunreinigungen zu. Die
Datenanalyse erfolgte mittels der Software Q-Gene [38]. Für die Auftragung der Auf/Ab-
Regulierung wurde die MNE (mittlere normalisierte Expression) gegenüber der internen
Kontrolle ama-1 mittels Prozedur 2 bestimmt.
Formel: [38] MNE =
( E
t arg et
( E
)
ref
CT
)
t arg et , well1
CT
ref , well1
CT
CT
t arg et , well 2
ref , well 2
3
45
3
CT
CT
t arg et , well 3
ref , well 3
( E
t arg et
( E
ref
)
)
CT
CT
t arg et , mean
ref , mean
Die Ergebnisse der Lightcycler real-time RT-PCR-Amplifikationen wurden mit
Microsoftt ® Excel ® dargestellt. Die Ermittlung der Signifikanzen erfolgte mit dem
Wilcoxon Signed-Ranks Test.
2.2.11 Identifizierung des pep-2 Knockouts in den Wurmstämmen
pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16
Diese Überprüfung war notwendig, da ein schnelleres Wachstum bei dem C. elegans-
Stamm pep-2;daf-2;daf-16 beobachtet wurde, welches annähernd dem Wachstum des
Wildtypstammes N2 entsprach. Dies war jedoch widersprüchlich zu dem verlangsamten
Wachstum, welches bei einem pep-2 Knockout beobachtet wird. Es werden je zwei
Würmer der Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16 untersucht.
Dazu wird eine Nested PCR der genomischen DNA aus nur einem Wurm mit den zwei
unterschiedlichen Primerpaaren (siehe Punkt 2.1.5.2) durchgeführt. Bei der Nested PCR

verwendet man für eine zweite PCR mit dem Primerpaar 1 pep-2_for1 und pep-2_rev1
bzw. Primerpaar 2 pep-2_ko_for und pep-2_ko_rev das Produkt aus der ersten PCR mit
dem Primerpaar 1 pep-2_for1 und pep-2_rev1 als Template.
2.2.11.1 Wurmlyse
In der Wurmlyse wird die genomische DNA aus einem Wurm gewonnen. Zunächst wird
ein Mix aus 50 µl 2x WLB und 2,5 µl Proteinase K hergestellt. Dieser Mix reicht für etwa
15 Würmer. Je ein Wurm wird mit Hilfe einer Pipette in 3 µl Mix aufgenommen und in ein
0,2 µl Eppendorfgefäß überführt. Die Würmer werden anschließend zuerst bei 65°C für 1h
und dann bei 95°C für 10 min inkubiert. Dieses Wurmlysat wird im Anschluss direkt als
Template für die PCRs eingesetzt.
2.2.11.2 Wurm-PCR
Zu 1,5 bis 3 µl Wurmlysat werden direkt 24,5 µl Mastermix, bestehend aus 25 µl Taq-
Puffer (20 mM MgCl2), 25 µl 2 mM dNTP’s, 2 µl 100 pmol/µl pep-2_for1 bzw. pep-
2_ko_for, 2 µl 100 pmol/µl pep-2_rev1 bzw. pep-2_ko_rev und 3 µl Taq-Polymerase pro
10 Proben, pipettiert.
Das PCR-Programm für Primerpaar 1 ist wie folgt:
1. Zyklus: 2 min 93°C
2. – 36. Zyklus: 20 sec 93°C
30 sec 55°C
2 min 30 sec 72°C
∞ 10°C
Das Programm wurde für das Primerpaar 2 pep-2_ko_for und pep-2_ko_rev für spätere
Untersuchungen weiter optimiert, da die Elongationszeit zuvor zu lang gewählt wurde und
viele unspezifische Primeranlagerungen beobachtet wurden.
46

1. Zyklus: 2 min 93°C
2. – 36. Zyklus: 20 sec 93°C
30 sec 55°C
1 min 72°C
∞ 10°C
2.2.11.3 Agarosegelelektrophorese
Für die Agarosegelelektrophorese werden zu den Proben noch 2 µl 10x
Probenauftragspuffer hinzupipettiert, das Ganze gut gemischt und abzentrifugiert.
Zusammen mit 5 µl Längenstandard Gene Ruler TM DNA Ladder Mix werden die Proben
der Primeretablierung auf ein 1,5 %iges Agarosegel aufgetragen, während die Proben aus
der Wurm-PCR auf ein 1 %iges Agarosegel geladen werden. Als Laufpuffer dient 1x TAE.
Der Lauf dauert bei 80 V etwa 1 bis 1 ½ h.
2.2.11.4 Vereinzeln der pep-2;daf-2;daf-16 Würmer
Da die bisher verwendeten Würmer den pep-2(lg601) Knockout nicht besitzen, wird nach
einem Kandidaten gesucht, der diesen Knockout aufweist und von dem aus ausreichend
Würmer hochgezüchtet werden können, mit denen nun auch gearbeitet werden kann. Das
Vereinzeln wird wie folgt durchgeführt. Von einer Aufzuchtplatte werden 15 Würmer im
L4 Larvenstadium jeweils einzeln auf frische 6 cm Platten gesetzt. Man lässt jeden
Kandidaten solange auf der Platte bis genügend Nachkommen vorhanden sind, auf die man
zurückgreifen kann, falls das Ergebnis positiv für den pep-2(lg601) Knockout ausfällt. Die
DNA des erwachsene Wurm wird mittels Wurmlyse gewonnen und als Template für die
PCR genutzt.
47

3 Ergebnisse
3.1 Identifizierung des pep-2(lg601) Knockouts in den Wurm-
stämmen pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16
Da für den C. elegans-Stamm pep-2;daf-2;daf-16 ein schnelleres Wachstum beobachtet
werden konnte, welches annähernd dem Wachstum des Wildtypstammes N2 entsprach,
wurde für alle Wurmstämme, die in späteren Versuchen verwendeten werden sollten, eine
Wurmlyse zur Gewinnung genomischer DNA und anschließend eine PCR für jedes
Primerpaar durchgeführt. Die Primerpaare waren so gewählt, dass sie spezifisch den
Knockout des pep-2(lg601) Allels anzeigen (siehe Abb. 14, Punkt 2.1.5.2), wobei das
Primerpaar 2 pep-2_ko_for und pep-2_ko_rev die Homozygotie des Knockouts nachweist
(unveröffentlichte Daten).
3 kb
2 kb
0,5 kb
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Abb. 18: DNA-Agarosegel (1 %ig) zur Überprüfung des pep-2(lg601) Knockouts in den
C. elegans-Stämmen pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16. Als Kontrolle wurden N2
Würmer mitgeführt. (1) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix (2) N2 (3) N2 (4) pep-2 (5) pep-2
(6) pep-2;daf-2;daf-16 (7) pep-2;daf-2;daf-16 (8) pep-2;daf-2 (9) pep-2;daf-2.
In Abb. 14 ist dargestellt wie das Kontrollgel für einen bestehenden pep-2 Knockout für
beide Primerpaare aussehen soll. Aus Abb. 18 wird jedoch deutlich, dass der Wurmstamm
pep-2;daf-2;daf-16 diesen Knockout nicht besitzt, da er Bandenmuster aufweist, die dem
des Wildtyps entsprechen. Somit konnte mit den Wurmstämmen N2, pep-2, und pep-2;daf-
2 weitergearbeitet werden. Jedoch musste für den Wurmstamm pep-2;daf-2;daf-16 im
48
2. PCR mit Primerpaar 2

Laborbestand nach einem neuen Kandidaten gesucht werden, von dem ausgehend die
Versuche fortgesetzt werden konnten.
3.2 „Aufspüren― eines Wurmes mit dem Tripelknockout pep-2;
daf-2;daf -16
3.2.1 Vorauswahl der Kandidaten
Zunächst musste eine Vorauswahl von Kandidaten getroffen werden. Dazu wurden von
einer Platte 15 Würmer genommen, die jeweils auf eine eigene 6 cm Platte gesetzt werden.
Diese vereinzelten Würmer wurden dann, nachdem sie genügend Nachkommen produziert
hatten, in einer Wurmlyse für die spätere PCR vorbereitet.
3 kb
2 kb
0,5 kb
Abb. 19: DNA-Agarosegel (1 %ig) der Produkte aus der PCR mit Primerpaar 1 zur
Identifizierung des pep-2 Mutantenallels in 15 gesingelten Würmern des C. elegans-
Stammes pep-2;daf-2;daf-16. (1) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix (2) Kandidat 1
(3) Kandidat 2 (4) Kandidat 3 (5) Kandidat 4 (6) Kandidat 5 (7) Kandidat 6 (8) Kandidat 7
(9) Kandidat 8 (10) Kandidat 9 (11) Kandidat 10 (12) Kandidat 11 (13) Kandidat 12
(14) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix (15) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix (16) Kandidat
13 (17) Kandidat 14 (18) Kandidat 15.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
15 16 17 18
49

3 kb
2 kb
0,5 kb
Abb. 20: DNA-Agarosegel (1 %ig) der Produkte aus der PCR mit Primerpaar 2 zur
Überprüfung der Homozygotie des pep-2 Knockouts in den 15 gesingelten Würmern des
C. elegans-Stammes pep-2;daf-2;daf-16. (1) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix (2) Kandidat
1 (3) Kandidat 2 (4) Kandidat 3 (5) Kandidat 4 (6) Kandidat 5 (7) Kandidat 6 (8) Kandidat
7 (9) Kandidat 8 (10) Kandidat 9 (11) Kandidat 10 (12) Kandidat 11 (13) Kandidat 12
(14) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix (15) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix (16) Kandidat
13 (17) Kandidat 14 (18) Kandidat 15. Die Pfeile bezeichnen die Kandidaten, welche im
Folgenden näher untersucht werden.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
15 16 17 18
Die Ergebnisse der 1. PCR mit dem Primerpaar 1 (Abb. 19) weisen darauf hin, dass alle
untersuchten Kandidaten den pep-2 Knockout besitzen, da die Wildtyp-Bande bei 2,1 kb
fehlt und bei 0,5 kb eine Bande erkennbar ist, wie sie für den pep-2 Knockout bezeichnend
ist (siehe Punkt 2.1.5.2 Abb. 14). Jedoch kann hier noch keine Aussage über die
Homozygotie des Knockouts getroffen werden. Betrachtet man jedoch die Produkte aus
der PCR mit dem Primerpaar 2, so findet man vier Kandidaten, welche nur sehr schwache
Banden bei 0,4 kb aufweisen (Abb. 20). Ein homozygoter Knockout würde hier kein
Bande zeigen. Deshalb wurden die Kandidaten 5, 6, 7 und 14 nochmals im Vergleich zum
Wildtyp überprüft, wobei die PCR weiter optimiert wurde.
50

3.2.2 Überprüfung der Kandidaten aus der Vorauswahl
Die zuvor ausgewählten Kandidaten werden nun intensiver auf Homozygotie überprüft, da
bei diesen Kandidaten, wenn auch nur schwach, Banden der Größe 0,4 kb im
entsprechenden Agarosegel (Abb. 20) zu erkennen sind. Mittels einer weiteren PCR mit
dem Primerpaar 2, sollte kontrolliert werden, ob es sich dabei möglicherweise nur um
unspezifische Produkte handelt. Dazu wurde auch das Programm für die PCR weiter
optimiert, wie es unter Punkt 2.2.11.2 beschrieben ist. Von den vier Kandidaten 5, 6, 7 und
14 werden jeweils 13 Würmer von der Platte genommen und pro Wurm die genomische
DNA isoliert.
Kandidat 5 Kandidat 7
A B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Abb. 21A: DNA-Agarosegel (1 %ig) der Produkte aus der PCR mit Primerpaar 2 zur
intensiveren Überprüfung der Kandidaten 5 und 6 des C. elegans-Stammes pep-2;daf-
2;daf-16 auf Homozygotie des pep-2 Knockouts. Als Kontrolle wurden N2 Würmer
mitgeführt. (1) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix (2) Wildtypkontrolle N2
(3)-(13) Nachkommen Kandidat 5 (14) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix (15) Gene
Ruler TM DNA Ladder Mix (16) Wildtypkontrolle N2 (17)-(27) Nachkommen Kandidat 6
(28) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix. B: DNA-Agarosegel (1 %ig) der Produkte aus der
PCR mit Primerpaar 2 zur intensiveren Überprüfung der Kandidaten 7 und 14 des
C. elegans-Stammes pep-2;daf-2;daf-16 auf Homozygotie des pep-2 Knockouts. Als
Kontrolle wurden N2 Würmer mitgeführt. (1) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix
(2) Wildtypkontrolle N2 (3)-(13) Nachkommen Kandidat 7 (14) Gene Ruler TM DNA
51
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Kandidat 6 Kandidat 14
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
3 kb
2 kb
0,5 kb

Ladder Mix (15) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix (16) Wildtypkontrolle N2
(17)-(27) Nachkommen Kandidat 14 (28) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix.
Aus den Abbildungen Abb. 21 A und B kann man zum einen entnehmen, dass die
Änderung des PCR Programms für das Primerpaar 2 erfolgreich war. Die unspezifischen
Banden konnten vermindert werden, während die Wildtypkontrolle das Funktionieren der
PCR belegt. Zum anderen kann entnommen werden, dass Kandidat 5 homozygot für den
pep-2 Knockout ist und man daher für die weiteren Versuche von diesem Wurm ausgeht.
3.3 RNA-Präperationen
Die Qualität der mRNA Isolierung aus den vier C. elegans Stämmen N2, pep-2, pep-2;
daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16 wurde mittels der unter Punkt 2.2.7 beschriebenen Methode
eines RNA-Agarosegels ermittelt. Hier ist beispielhaft eines dieser RNA-Kontrollgele für
den Stamm pep-2;daf-2 abgebildet.
Abb. 22: RNA-Agarosegel zur Überprüfung der mRNA-Qualität für die nachfolgende
cDNA-Synthese. Aufgetragen wurde je 1 µg mRNA der drei Larvenstadien L2, L3 und L4
des Stammes pep-2;daf-2.
Das Gelfoto belegt, dass die mRNA Isolierung erfolgreich war. Es sind keine Banden
degradierter mRNA zu erkennen. Zudem laufen 28S- und 18S-RNA-Moleküle in zwei
scharfe, definierten Banden, wobei die untere 18S-Bande etwa ein Drittel der oberen 28S
Bande darstellt.
L2 L3 L4
52

3.4 Primeretablierung
Beim Primerdesign ist darauf zu achten, dass die Primerpaare nicht nur spezifisch sind,
sondern auch keine Sekundärstrukturen, wie Hairpins und Primerdimere bilden. Während
der Primeretablierung wird ausgetestet, bei welcher Annealing-Temperatur die
Primerpaare sowohl das gewünschte Produkt liefern, als auch keine Sekundärstrukturen
und unspezifische Produkte hervorrufen. Die Primerpaare wurden für eine Annealing-
Temperatur von 60°C designed. Neben dieser Temperatur wurde jedoch noch eine
Temperatur von 62°C getestet, welche sich als die geeignetere für die meisten Primerpaare
herausstellte (siehe Abbildungen 23-27). Die Produktlängen für die einzelnen Primerpaare
sind in Tabelle aufgeführt.
0,5 kb
Abb. 23: DNA-Agarosegel (1,5 %) für die Primeretablierung der Primerpaare zur
Amplifiktion der Gene aat-1, aat-3 und ama-1 für eine Annealing-Temperatur von 62°C.
(1) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix (2)+(3) aat-1 (4)+(5) aat-3 (6)+(7) ama-1.
0,5 kb
Abb. 24: DNA-Agarosegel (2 %) für die Primeretablierung der Primerpaare zur
Amplifiktion der Gene aat-2, aat-8, aat-9, atg-1 und atg-2 für eine Annealing-Temperatur
von 62°C. (1) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix (2) aat-2 (3) aat-8 (4) aat-9 (5) atg-1
(6) atg-2.
1 2 3 4 5 6 7
1 2 3 4 5 6
53

0,5 kb
0,5 kb
0,5 kb
1 2 3 4 5
Abb. 25: DNA-Agarosegel (2 %) für die Primeretablierung der Primerpaare zur
Amplifiktion der Gene aat-4, aat-5, aat-6 und aat-7 für eine Annealing-Temperatur von
62°C. (1) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix (2) aat-4 (3) aat-5 (4) aat-6 (5) aat-7.
1 2 3 4 5 6 7 8
Abb. 26: DNA-Agarosegel (2 %) für die Primeretablierung des Primerpaares zur
Amplifiktion des Gens gcs-1 für eine Annealing-Temperatur von 62°C. (1) Gene
Ruler TM DNA Ladder Mix (2)-(7) gcs-1 (8) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix.
1 2 3 4
Abb. 27: DNA-Agarosegel (2 %) für die Primeretablierung der Primerpaare zur
Amplifiktion der Gene T27A1.5, Y43F4B.7 und nhx-2 für eine Annealing-Temperatur von
60°C. (1) Gene Ruler TM DNA Ladder Mix (2) T27A1.5 (3) Y43F4B.7 (4) nhx-2.
54

Die Gelfotos Abb. 23-27 zeigen, dass alle Primerpaare, bis auf das Primerpaar zur
Amplifiktion des Gens aat-7, auf welches später auch für die Lightcycler Amlifikationen
verzichtet wurde, das gewünschte Produkt liefern und darüber hinaus auch keine
Sekundärstrukturen bilden. Als geeignetste Annealing-Temperatur wurde für die
Primerpaare zur Amplifikation der Gene aat-1, -2, -3, -4, -5, -6, -8, -9, atg-1, -2, gcs-1 und
ama-1 die Temperatur von 62°C ermittelt. Zur Amplifikation der Gene T27A1.5,
Y43F4B.7 und nhx-2 wird jedoch eine Annealing-Temperatur von 60°C verwendet.
3.5 Lightcycler real-time RT-PCR
In den folgenden Abbildungen werden in den Abbildungsunterschriften die P-Werte für die
Signifikanz der Ergebnisse angegeben. Diese Signifikanz wurde mit dem Wilcoxon
Signed-Ranks Test ermittelt. Der angegebene Wert gilt für alle Ergebnisse, die in der
Abbildung dargestellt werden. Die Signifikanz ergibt sich dabei aus dem Vergleich der
Expressionswerte des Wildtypstammes mit dem jeweiligen Knockoutstamm, wobei ein
Larvenstadium des Wildtypstammes mit dem entsprechenden Larvenstadium des
Knockoutstammes verglichen wird.
55

3.5.1 Heteromere Aminosäuretransporter
Mittlere normalisierte Expression
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
N2 L2
N2 L3
N2 L4
pep-2 L2
aat-1 mRNA-Expressionsmuster
pep-2 L3
pep-2 L4
56
pep-2;daf-2 L2
pep-2;daf-2 L3
pep-2;daf-2 L4
pep-2;daf-2;daf-16 L2
pep-2;daf-2;daf-16 L3
pep-2;daf-2;daf-16 L4
Abb. 28: mRNA-Expressionsmuster für aat-1 in den drei Larvenstadien L2, L3 und
L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16.
P (Signifikanz) < 0,005.
Vergleicht man die einzelnen Wurmstämme, so weist Abbildung 28 für das Gen aat-1 eine
deutliche Erhöhung der mRNA-Expression in der Doppelmutante pep-2;daf-2 gegenüber
den anderen Wurmstämmen auf. Dabei ist die mRNA-Expression in den Larvenstadien L2
und L3 etwa zweifach und in L4 etwa dreifache gegenüber dem Wildtypstamm N2
gesteigert. Der Effekt des pep-2 Knockouts im Wurmstamm pep-2 ist eine Erniedrigung im
Larvenstadium L3 um ca. 1/3 im Vergleich zu N2. Für den Dreifach-Knockout im
Wurmstamm pep-2;daf-2;daf-16 ist wieder eine Annäherung an den Wildtyp zu erkennen.
L2 und L3 zeigen eine mRNA-Expression, die etwa 2/3 der mRNA-Expression im Wildtyp
entspricht, wohingegen L4 gegenüber N2 noch um 1/3 erhöht vorliegt.
Innerhalb der einzelnen Wurmstämme sieht das mRNA-Expressionsmuster von aat-1 so
aus, dass im Wildtypstamm L3 zweifach gegenüber L2 und L4 erhöht ist. Dagegen scheint
im Wurmstamm pep-2 kein entwicklungsbedingter Effekt vorhanden zu sein, da in allen
Larvenstadien eine vergleichbare mRNA-Expression für aat-1gemessen wurde. Für pep-

2;daf-2 ist jedoch wieder ein unterschiedliches mRNA-Expressionsmuster zwischen den
einzelnen Larvenstadien erkennbar. L3 besitzt dabei die höchste mRNA-Expression,
welche gegenüber L2 um 1/3 zugenommen hat. L4 nähert sich etwa der mRNA-Expression
im Larvenstadium L3 an. Die mRNA-Expression im Wurmstamm pep-2;daf-2;daf-16
nimmt von L2 über L3 zu L4 um ca. 1/3 zu. Demnach besteht auch hier eine
entwicklungsstadiumsbedingte Wirkung auf die mRNA-Expression.
Mittlere normalisierte Expression
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
N2 L2
N2 L3
N2 L4
pep-2 L2
aat-2 mRNA-Expressionsmuster
pep-2 L3
pep-2 L4
57
pep-2;daf-2 L2
pep-2;daf-2 L3
pep-2;daf-2 L4
pep-2;daf-2;daf-16 L2
pep-2;daf-2;daf-16 L3
pep-2;daf-2;daf-16 L4
Abb. 29: mRNA-Expressionsmuster für aat-2 in den drei Larvenstadien L2, L3 und
L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16.
P (Signifikanz) < 0,005.

In Abbildung 29 ist auffällig, dass die Doppelmutation in pep-2;daf-2 zu einer
Erniedrigung der mRNA-Expression des Gens aat-2 in allen Larvenstadien um etwa die
Hälfte gegenüber dem Wildtyp führt. Für pep-2 besteht eine Abnahme der mRNA-
Expression im Larvenstadium L2 um fast 2/3 gegenüber N2, jedoch besitzen L3 eine
gesteigerte mRNA-Expression um ca. 1/3 und auch in L4 beobachtet man eine Steigerung
auf das Doppelte im Vergleich zum Wildtyp. Der Wurmstamm pep-2;daf-2;daf-16 zeigt
eine deutliche Zunahme der mRNA-Expression im Larvenstadium L3 verglichen mit N2
um etwa das Dreifache. Die mRNA-Expression in L2 entspricht der im Wildtyp, dagegen
ist die mRNA-Expression in L4 gegenüber N2 noch doppelt so hoch.
In allen vier Stämmen ist kein Trend für eine entwicklungsbedingten Effekt zu erkennen.
Im Wildtypstamm ist die mRNA-Expression im Larvenstadium L3 am stärksten, jedoch
besitzt L2 in etwa den gleichen mRNA-Expressionslevel. In L4 dagegen ist die mRNA-
Expression um die Hälfte reduziert. Die mRNA-Expression in pep-2 nimmt vom
Larvenstadium L2 zu L3 um das Dreifache zu. Zwischen L3 und L4 ist nur eine geringere
Abnahme der mRNA-Expression zu beobachten. Im Wurmstamm pep-2;daf-2 ist kaum ein
Effekt der verschieden Entwicklungsstadien auf die mRNA-Expression zu beobachten.
Diese nimmt nur sehr leicht von L2 über L3 zu L4 ab. Wie bereits beschrieben, zeigt pep-
2;daf-2;daf-16 eine drastische Steigerung der mRNA-Expression im Larvenstadium L3
gegenüber dem Wildtyp. Diese Steigerung ist aber auch im Vergleich der Larvenstadien
sehr deutlich auf das Dreifache. L2 und L4 sind wieder nahezu gleich.
58

Mittlere normalisierte Expression
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
N2 L2
N2 L3
N2 L4
pep-2 L2
aat-3 mRNA-Expressionsmuster
pep-2 L3
pep-2 L4
59
pep-2;daf-2 L2
pep-2;daf-2 L3
pep-2;daf-2 L4
pep-2;daf-2;daf-16 L2
pep-2;daf-2;daf-16 L3
pep-2;daf-2;daf-16 L4
Abb. 30: mRNA-Expressionsmuster für aat-3 in den drei Larvenstadien L2, L3 und
L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16.
P (Signifikanz) < 0,005.
Das mRNA-Expressionsmuster für aat-3 (Abb. 30) im Vergleich der verschiedenen
Wurmstämme ergibt, dass der Knockout von pep-2 eine Reduktion der mRNA-Expression
gegenüber den drei anderen Wurmstämmen bewirkt. Die Unterschiede der anderen drei
Stämme untereinander sind weniger ausgeprägt. Dabei ist die mRNA-Expression im
Larvenstadium L2 und L3 für N2 und pep-2; daf-2 beinahe identisch und auch im Stamm
pep-2; daf-2; daf-16 ist die mRNA-Expression in L2 nur um 1/3 und L3 nur geringfügig
gegenüber den beiden anderen Stämmen vermindert. Das Larvenstadium L4 ist in den
Stämmen pep-2; daf-2 und pep-2; daf-2; daf-16 vergleichbar und gegenüber N2 um 1/3
erhöht.
Innerhalb der einzelnen Wurmstämme zeichnet sich ein Trend für einen
entwicklungsbedingten Effekt ab. Die mRNA-Expression nimmt in allen Wurmstämmen
von L2 über L3 zu L4 hin ab. Im Wildtypstamm verringert sich die mRNA-Expression in
L3 um 1/3 und in L4 beträgt die mRNA-Expression nur noch ¼ verglichen mit L2. Die
mRNA-Expressionsabnahme im pep-2 Knockoutstamm ist nicht so stark ausgeprägt. Die
mRNA-Expression in L4 stellt immer noch 2/3 von der mRNA-Expression in L2 dar. Im

Wurmstamm pep-2;daf-2 beobachtet man eine ähnliche Abnahme wie in N2, nur dass in
L4 die Reduktion auf etwa die Hälfte und nicht ¼ stattfindet. pep-2;daf-2;daf-16 weist
keinen Unterschied zwischen Larvenstadium L2 und L3 auf. Die mRNA-Expression in L4
jedoch ist ca. auf 2/3 verringert.
Mittlere normalisierte Expression
0 ,1 4
0 ,1 2
0 ,1
0 ,0 8
0 ,0 6
0 ,0 4
0 ,0 2
0
N2 L2
N2 L3
N2 L4
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
pep-2 L2
aat-4 mRNA-Expressionsmuster
pep-2 L3
pep-2 L4
60
pep-2; daf-2 L2
pep-2; daf-2 L3
pep-2; daf-2 L4
pep-2; daf-2; daf-16 L2
pep-2; daf-2; daf-16 L4
pep-2; daf-2; daf-16 L3
Abb. 31: mRNA-Expressionsmuster für aat-4 in den drei Larvenstadien L2, L3 und
L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16. Das
kleine Fenster zeigt dieselben Ergebnisse in der Skala, wie sie für die stärker
exprimierten Gene verwendet wurde. P (Signifikanz) < 0,005.
Die mRNA-Expression des Gens aat-4 (Abb. 31) ist verglichen mit den zuvor untersuchten
Genen in allen Wurmstämmen sehr viel niedriger. Sie liegt unterhalb des Werts 0,1 der
mittlere normalisierte mRNA-Expression. Dagegen lag die mRNA-Expression der Gene
aat-1, aat-2 und aat-3 bei einem Wert von etwa 0,25 bis 3. Weiter findet man für die
beiden Stämme pep-2 und pep-2;daf-2 eine Abnahme der mRNA-Expression im Vergleich
zum Wildtypstamm und pep-2;daf-2;daf-16. Letzterer zeigt für die Larvenstadien L3 und
L4 sogar eine Erhöhung um 1/3 bzw. ½ gegenüber N2. L2 erreicht etwa 2/3 der mRNA-
Expression im Wildtyp. Der pep-2 Stamm weist für das Larvenstadium L2 eine mRNA-
Expression von noch etwa 1/5, für L3 und L4 von eine 1/3 der mRNA-Expression in N2
auf. In pep-2;daf-2 nimmt die mRNA-Expression in den Larvenstadien L2 und L4 wieder

leicht zu und beträgt ca. ½ der mRNA-Expression im Wildtyp. L3 ist unverändert
gegenüber pep-2. Im Folgenden soll nicht mehr näher auf das mRNA-Expressionsmuster
von aat-4 eingegangen werden, da aufgrund einer so geringen mRNA-Expression keine
genauen Aussagen getroffen werden können, welche eine Diskussion sinnvoll machen.
Dasselbe gilt für die mRNA-Expressionsmuster der Gene aat-5, aat-6, aat-8 und atg-1.
Mitllere normalisierte Expression
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
N2 L2
N2 L3
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
N2 L4
pep-2 L2
aat-5 mRNA-Expressionsmuster
pep-2 L3
pep-2 L4
61
pep-2;daf-2 L2
pep-2;daf-2 L3
pep-2;daf-2 L4
pep-2;daf-2;daf-16 L2
pep-2;daf-2;daf-16 L4
pep-2;daf-2;daf-16 L3
Abb. 32: mRNA-Expressionsmuster für aat-5 in den drei Larvenstadien L2, L3 und
L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16. Das
kleine Fenster zeigt dieselben Ergebnisse in der Skala, wie sie für die stärker
exprimierten Gene verwendet wurde. P (Signifikanz) < 0,005.
Auch für das Gen aat-5 konnte nur ein geringer mRNA-Expressionslevel mit einem Wert
kleiner 0,9 gemessen werden (Abb. 32). Abgesehen vom L2 Larvenstadium in N2, nimmt
die mRNA-Expression von N2 über pep-2 und pep-2;daf-2 zu pep-2;daf-2;daf-16 hin zu.
Auffällig ist hierbei, dass vor allem das Larvenstadium L3 eine drastische Steigerung in
der mRNA-Expression aufweist. Das Larvenstadium L2 ist in N2 gegenüber dem
Wurmstamm pep-2 fast dreifach und gegenüber pep-2;daf-2 fast zweifach erhöht. Im
Wurmstamm pep-2;daf-2;daf-16 nähert sich die mRNA-Expression der L2 Larven dem im
Wildtyp nahezu an. Dagegen findet man für die L3 Larven eine annähernde Verdopplung

im Stamm pep-2, eine Verfünffachung im Wurmstamm pep-2;daf-2 und eine
Versechsfachung in den pep-2;daf-2;daf-16 Würmern im Vergleich zum Wildtyp. Für das
L4 Larvenstadium ist annähernd dieselbe Beobachtung zu machen.
Mittlere normalisierte Expression
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
N2 L2
N2 L3
N2 L4
pep-2 L2
aat-6 mRNA-Expressionsmuster
pep-2 L3
pep-2 L4
62
pep-2;daf-2 L2
pep-2;daf-2 L3
pep-2;daf-2 L4
pep-2;daf-2;daf-16 L3
pep-2;daf-2;daf-16 L2
pep-2;daf-2;daf-16 L4
Abb. 33: mRNA-Expressionsmuster für aat-6 in den drei Larvenstadien L2, L3 und
L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16. Das
kleine Fenster zeigt dieselben Ergebnisse in der Skala, wie sie für die stärker
exprimierten Gene verwendet wurde. P (Signifikanz) < 0,005.
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Der mRNA-Expressionslevel für das Gen aat-6 ist vergleichbar mit dem für das Gen aat-5
und besitzt ebenfalls einen Wert kleiner als 0,8 (siehe Abb. 33), weswegen nicht sonderlich
ausführlich auf das mRNA-Expressionsmuster eingegangen werden soll. Jedoch ist
auffällig, dass die mRNA-Expression im Wurmstamm pep-2;daf-2;daf-16 bis über
zehnfach erhöht ist. Wobei zu bedenken ist, dass der mRNA-Expressionslevel in allen
Wurmstämmen ohnehin schon sehr niedrig ist. Die mRNA-Expression im Larvenstadium
L2 ist für N2 (0,26) und pep-2;daf-2;daf-16 (0,22) in etwa identisch, jedoch gegenüber den
beiden anderen Wurmstämmen beobachtet man eine Reduktion auf ca. 1/5 (pep-2: 0,04
bzw. pep-2;daf-2: 0,05). Das Larvenstadium L3 besitzt in den Wurmstämmen N2 (0,07),

pep-2 (0,04) und pep-2;daf-2 (0,05) eine vergleichbare mRNA-Expression, die wie bereits
erwähnt auf das über zehnfache im Wurmstamm pep-2;daf-2;daf-16 (0,76) ansteigt.
Mittlere normalisierte Expression
0,05
0,045
0,04
0,035
0,03
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
N2 L2
N2 L3
N2 L4
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
pep-2 L2
aat-8 mRNA-Expressionsmuster
pep-2 L3
pep-2 L4
63
pep-2;daf-2 L2
pep-2;daf-2 L3
pep-2;daf-2 L4
pep-2;daf-2;daf-16 L3
pep-2;daf-2;daf-16 L2
pep-2;daf-2;daf-16 L4
Abb. 34: mRNA-Expressionsmuster für aat-8 in den drei Larvenstadien L2, L3 und
L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16. Das
kleine Fenster zeigt dieselben Ergebnisse in der Skala, wie sie für die stärker
exprimierten Gene verwendet wurde. P (Signifikanz) < 0,005.
Der Expressionslevel für das Gen aat-8 liegt für die meisten Proben weit unterhalb dem
Wert von 0,1 (Abb. 34). Aufgrund dieser sehr geringen mRNA-Expression kann keine
aussagekräftige Diskussion der Ergebnisse durch geführt werden, weshalb hier auch nicht
mehr näher auf das mRNA-Expressionsmuster von aat-8 eingegangen wird.

Mittlere normalisierte Expression
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
N2 L2
N2 L3
N2 L4
pep-2 L2
aat-9 mRNA-Expressionsmuster
pep-2 L3
pep-2 L4
64
pep-2;daf-2 L2
pep-2;daf-2 L3
pep-2;daf-2 L4
pep-2;daf-2;daf-16 L2
pep-2;daf-2;daf-16 L3
pep-2;daf-2;daf-16 L4
Abb. 35: mRNA-Expressionsmuster für aat-9 in den drei Larvenstadien L2, L3 und
L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16.
P (Signifikanz) < 0,005.
Der Wurmstamm pep-2 weist die niedrigste mRNA-Expression für das Gen aat-9 auf,
während pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16 für die Larvenstadien L2 und L4 sich wieder
an den Wildtypstamm annähern (Abb. 35). Die mRNA-Expression in den L3 Larven ist im
Wildtyp etwa um 1/3 höher als in besagten Stämmen. Darüber hinaus ist die mRNA-
Expression in den pep-2; daf-2;daf-16 Würmern etwas geringer als im Stamm pep-2;daf-
2. Im Wurmstamm pep-2 beträgt die mRNA-Expression im Larvenstadium L2 1/3, in L3
1/5 und in L4 etwa ½ der mRNA-Expression in N2.
Im Vergleich der einzelnen Larvenstadien innerhalb eines Wurmstammes zeigt nur der
Wildtypstamm einen deutlichen Unterschied zwischen der mRNA-Expression in den
Larvenstadien L2 und L4 zu den L3 Larven. Diese ist in den L3 Larven verdoppelt. Eine
Erhöhung der L3 Larven gegenüber den L2 und L4 Larven findet man auch in den
Stämmen pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16, jedoch ist der Unterschied hier nicht sehr
stark ausgeprägt und eventuell vernachlässigbar. Im Wurmstamm pep-2 nimmt die mRNA-
Expression von den L2 Larven üb der L3 zu den L4 Larven auf das Doppelte zu.

3.5.2 Glykoproteinuntereinheiten der heteromeren Aminosäure-
transporter
Mittlere normalisierte Expression
1
0 ,9
0 ,8
0 ,7
0 ,6
0 ,5
0 ,4
0 ,3
0 ,2
0 ,1
0
N2 L2
N2 L3
N2 L4
pep-2 L2
atg-1 mRNA-Expressionsmuster
pep-2 L3
pep-2 L4
65
pep-2;daf-2 L2
pep-2;daf-2 L3
pep-2;daf-2 L4
pep-2;daf-2;daf-16 L2
pep-2;daf-2;daf-16 L3
pep-2;daf-2;daf-16 L4
Abb. 36: mRNA-Expressionsmuster für atg-1 in den drei Larvenstadien L2, L3 und
L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16. Das
kleine Fenster zeigt dieselben Ergebnisse in der Skala, wie sie für die stärker
exprimierten Gene verwendet wurde. P (Signifikanz) < 0,005.
Abbildung 36 zeigt, dass die mRNA-Expression in den verschiedenen Wurmstämmen von
pep-2 über pep-2;daf-2 zu pep-2;daf-2;daf-16 gegenüber dem Wildtypstamm zunimmt.
Die höchste mRNA-Expression im Stamm pep-2;daf-2;daf-16 liegt unterhalb einem Wert
von 0,6 und ist damit eher niedrig im Vergleich zu den mRNA-Expressionsleveln, wie sie
im Laufe dieser Untersuchungen wie z.B. für die Gene aat-1, aat-2, aat-3 und aat-9
gefunden wurden. Deshalb soll auch hier nicht mehr näher auf die mRNA-Expression
dieses Gens eingegangen werden.
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0

Mittlere normalisierte Expression
3 ,5
3
2 ,5
2
1 ,5
1
0 ,5
0
N2 L2
N2 L3
N2 L4
pep-2 L2
atg-2 mRNA-Expressionsmuster
pep-2 L3
pep-2 L4
66
pep-2;daf-2 L2
pep-2;daf-2 L3
pep-2;daf-2 L4
pep-2;daf-2;daf-16 L2
pep-2;daf-2;daf-16 L3
pep-2;daf-2;daf-16 L4
Abb. 37: mRNA-Expressionsmuster für atg-2 in den drei Larvenstadien L2, L3 und
L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16.
P (Signifikanz) < 0,005.
Der Vergleich der mRNA-Expressionsmuster (Abb. 37) für das Gen atg-2 in den
verschiedenen Wurmstämmen zeigt für die L2 Larven des Wildtypstammes eine um etwa
3,5-fache Erhöhung der mRNA-Expression gegenüber den höchsten mRNA-Expressionen
in den anderen Wurmstämmen. Dabei ist im Wurmstamm pep-2 die mRNA-Expression
nur ca. 1/13 der mRNA-Expression im Wildtypstamm, im Wurmstamm pep-2;daf-2 1/6
und im Stamm pep-2;daf-2;daf-16 etwa 1/4. Für das Larvenstadium L3 findet man
annähernd identische mRNA-Expressionslevel in den Wurmstämmen N2, pep-2;daf-2 und
pep-2;daf-2;daf-16, während die mRNA-Expression im Stamm pep-2 nur 1/3 der mRNA-
Expression in den anderen Stämmen entspricht. Die mRNA-Expression im Larvenstadium
L4 nimmt in allen Wurmstämmen gegenüber dem Wildtyp zu. So ist die mRNA-
Expression im Stamm pep-2 verdreifacht, im Stamm pep-2;daf-2 fast verdoppelt und in
den zu pep-2;daf-2;daf-16 Larven wieder etwa verdreifacht.
Betrachtet man die einzelnen Wurmstämme für sich, dann weist der Wildtypstamm sehr
drastische Unterschiede zwischen den einzelnen Larvenstadien auf. Die mRNA-Expression
in den L2 Larven ist gegenüber den L3 Larven mehr als verdreifacht und gegenüber den
L4 Larven mehr als verzehnfacht. Im Stamm pep-2 nimmt die mRNA-Expression von den

L2 Larven über die L3 Larven zu den L4 Larven auf das etwa Dreifache zu. Zwischen L2
und L3 Larven ist nur eine sehr geringe Änderung von etwa ¼ zu beobachten. Die pep-
2;daf-2 Larven zeigen im L3 Larvenstadium die höchsten mRNA-Expressionswerte, die
ca. doppelt so hoch sind wie in den L2 und L4 Larven, wobei hier der Unterschied eine
Abnahme der mRNA-Expression ¼ in den L2 Larven zu den L4 Larven darstellt. Auch im
Wurmstamm pep-2;daf-2;daf-16 besitzen die L3 Larven die höchste mRNA-Expression.
L2 und L4 Larven zeigen eine nahezu identische mRNA-Expression, welche ¼ gegenüber
der mRNA-Expression in den L3 Larven abgenommen hat.
3.5.3 Lysosomale Aminosäuretransporterhomologe
Mittlere normalisierte Expression
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
N2 L2
N2 L3
N2 L4
pep-2 L2
T27A1.5 mRNA-Expressionsmuster
pep-2 L3
pep-2 L4
67
pep-2;daf-2 L2
pep-2;daf-2 L3
pep-2;daf-2 L4
pep-2;daf-2;daf-16 L2
pep-2;daf-2;daf-16 L3
pep-2;daf-2;daf-16 L4
Abb. 38: mRNA-Expressionsmuster für T27A1.5 in den drei Larvenstadien L2, L3
und L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16.
P (Signifikanz) < 0,005.
Das Gen T27A1.5 wird in allen untersuchten Wurmstämmen in einem relativ hohen Maße
exprimiert (Abb. 38), dabei weist der pep-2 Knockoutstamm durchschnittlich den
niedrigsten mRNA-Expressionslevel auf. Die höchsten mRNA-Expressionswerte werden
im Wurmstamm pep-2;daf-2;daf-16 in den L3 Larven erreicht. Man beobachtet im
Wurmstamm pep-2 für das Larvenstadium L2 eine Abnahme der mRNA-Expression auf

etwa ein sechstel der mRNA-Expression im Wildtypstamm. Im Stamm pep-2;daf-2 nimmt
die mRNA-Expression jedoch wieder auf etwa die Hälfte der mRNA-Expression im
Wildtypstamm zu und die mRNA-Expression im Stamm pep-2;daf-2;daf-16 beträgt bereits
wieder 2/3 verglichen mit N2. Für das L3 Larvenstadium beobachtet man Ähnliches. Hier
nimmt die mRNA-Expression in den pep-2 Larven zunächst auf knapp 2/3 der
Wildtypexpression ab, steigt aber bereits in den pep-2;daf-2 Larven auf ¾ an und
übersteigt in den pep-2;daf-2;daf-16 Larven sogar die mRNA-Expression im Wildtyp.
Dagegen ist die mRNA-Expression in den L4 Larven des Stammes pep-2 verglichen mit
der mRNA-Expression in den L4 Larven beinahe identisch, nimmt in den pep-2;daf-2
Larven um etwa ¼ ab, steigt aber in den Larven des Stammes pep-2;daf-2;daf-16 auf das
Doppelte der Wildtypexpression an.
Innerhalb der einzelnen Wurmstämme zeichnet sich kein Trend für einen
entwicklungssbedingten Effekt ab. Aber dennoch beobachtet man deutliche Unterschiede
zwischen den Larvenstadien in den einzelnen Wurmstämmen. Während im Wildtypstamm
die mRNA-Expressionslevel der L2 und L3 Larven nahezu gleich sind, nimmt die mRNA-
Expression in den L4 Larven auf etwa 2/3 ab. Im Wurmstamm pep-2 weist das L2
Larvenstadium die niedrigste mRNA-Expression auf. Sie liegt bei ca. 1/3 der mRNA-
Expressionen in den L3 und L4 Larven, wobei die mRNA-Expression hier wieder nahezu
identisch ist. Die pep-2;daf-2 Larven des Stadiums L2 und L4 besitzen ebenfalls
vergleichbare mRNA-Expressionen. Die mRNA-Expression in den L3 Larven ist um 1/3
gegenüber der mRNA-Expression in den L2 und L4 Larven erhöht. Der Stamm pep-2;daf-
2;daf-16 zeigt in seinem mRNA-Expressionsmuster eine Zunahme der mRNA-Expression
vom Larvenstadium L2 zum Larvenstadium L4 um etwas mehr als 1/3. Die mRNA-
Expression nimmt dann aber in den L4 Larven wieder leicht ab.
68

Mittlere normalisierte Expression
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
N2 L2
N2 L3
N2 L4
Y43F4B.7 mRNA-Expressionsmuster
pep-2 L2
pep-2 L3
pep-2 L4
69
pep-2;daf-2 L2
pep-2;daf-2 L3
pep-2;daf-2 L4
pep-2;daf-2;daf-16 L3
pep-2;daf-2;daf-16 L2
pep-2;daf-2;daf-16 L4
Abb. 39: mRNA-Expressionsmuster für Y43F4B.7 in den drei Larvenstadien L2, L3
und L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16.
P (Signifikanz) < 0,005.
Der mRNA-Expressionslevel für das Gen Y43F4B.7 beträgt etwa die Hälfte des mRNA-
Expressionslevels für das Gen des zweiten untersuchten lysosomalen
Aminosäuretransporters. Des weiteren weist auch hier der pep-2 Knockoutstamm die
geringste mRNA-Expression auf (Abb. 39). Das L2 Larvenstadium besitzt eine mRNA-
Expression, welche nur noch 1/4 der mRNA-Expression im Wildtyp erreicht. In den L3
Larven liegt die mRNA-Expression bei etwa der Hälfte. Allerdings unterscheiden sich die
L4 Larven in ihrer mRNA-Expression nur sehr gering vom Wildtyp. Die mRNA-
Expression im Wurmstamm pep-2;daf-2 erreicht etwa das Level der mRNA-Expression im
Wildtypstamm. In den L4 Larven ist dieses sogar beinahe verdoppelt. Die mRNA-
Expression in den pep-2;daf-2;daf-16 L2 und L3 Larven nimmt gegenüber den L2 und L3
Larven im Stamm pep-2;daf-2 um ca. 1/3 ab. Dagegen bleibt die mRNA-Expression in den
L4 Larven gleich. Auch für die mRNA-Expression des Gens Y43F4B.7 ist kein deutlicher
Trend für entwicklungsbedingte Effekte zu erkennen. Im Wildtypstamm zeigen die L2 und
L3 Larven identische mRNA-Expressionslevel. Die mRNA-Expression in den L4 Larven
ist um die Hälfte reduziert. Im pep-2 Knockoutstamm beobachtet man eine leichte
Zunahme der mRNA-Expression vom L2 Larvenstadium hin zu den im vergleichbaren

Maße exprimierenden L3 und L4 Larven. Der mRNA-Expressionsunterschied im
Wurmstamm pep-2;daf-2 ist ebenfalls nicht sehr stark ausgeprägt. Die L3 Larven besitzen
die höchste mRNA-Expression, während die L2 Larven eine leicht niedrigere mRNA-
Expression aufweisen, und auch die L4 Larven eine um etwa 1/5 geringere mRNA-
Expression zeigen. Für den Stamm pep-2;daf-2; daf-16 ergibt sich ein ähnliches Bild,
wobei jedoch die mRNA-Expression von den L2 über die L3 zu den L4 Larven hin um ca.
¼ ansteigt.
3.5.4 gcs-1
Mittlere normalisierte Expression
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
N2 L2
N2 L3
N2 L4
pep-2 L2
gcs-1 mRNA-Expressionsmuster
pep-2 L3
pep-2 L4
70
pep-2;daf-2 L2
pep-2;daf-2 L3
pep-2;daf-2 L4
pep-2;daf-2;daf-16 L3
pep-2;daf-2;daf-16 L2
pep-2;daf-2;daf-16 L4
Abb. 40: mRNA-Expressionsmuster für gcs-1 in den drei Larvenstadien L2, L3 und
L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16.
P (Signifikanz) < 0,005.
Auch das mRNA-Expressionsmuster der Gens gcs-1 weist für den Stamm pep-2 den
niedrigsten mRNA-Expressionslevel auf (Abb. 40). Die mRNA-Expression nimmt im
Wurmstamm pep-2;daf-2 zu. Dies setzt sich im Stamm pep-2;daf-2;daf-16 weiter fort, so
dass die mRNA-Expression in den L3 und L4 Larven die des Wildtyps sogar übersteigt.
Die Abnahme der mRNA-Expression im Stamm pep-2 verglichen mit der mRNA-

Expression im Wildtypstamm beträgt für die L2 und L3 Larven 2/3. Die mRNA-
Expressionsabnahme in den L4 Larven ist nur sehr gering. Im Wurmstamm pep-2;daf-2 ist
der mRNA-Expressionslevel der L2 und L3 Larven identisch und erreicht für die L2
Larven noch knapp 2/3 und für die L3 Larven noch 3/4 der Wildtypexpression. Die
mRNA-Expression in den L4 Larven ist gleich der mRNA-Expression im Wildtyp. Die
mRNA-Expressionsänderungen im Wurmstamm pep-2;daf-2;daf-16 sind so gestaltet, dass
sich das mRNA-Expressionslevel in den L2 Larven dem im Wildtyp annähert. Dagegen
nimmt die mRNA-Expression in den L3 Larven sogar um die Hälfte der mRNA-
Expression des Wildtyps zu und in den L4 Larven kommt es zu einer Verdopplung der
mRNA-Expression.
Die mRNA-Expressionsänderungen innerhalb der Wurmstämme zeigen wiederum keinen
einheitlichen Trend. Die mRNA-Expression nimmt im Wildtypstamm vom L2
Larvenstadium über die L3 Larven zu den L4 Larven um zunächst ¼ auf weniger als die
Hälfte ab. Dagegen ist das mRNA-Expressionslevel im pep-2 für alle drei untersuchten
Larvenstadien nahezu gleich. Im pep-2;daf-2 Wurmstamm zeigen die L2 und L3 Larven
gleiche mRNA-Expressionen. In den L4 Larven ist die mRNA-Expression um 1/3
reduziert. Betrachtet man das mRNA-Expressionsmuster des Wurmstammes pep-2; daf-2;
daf-16, wird deutlich, dass die höchste mRNA-Expression bei den L3 Larven liegt,
während sich die L2 und L3 Larven in ihrer mRNA-Expression kaum unterscheiden und
eine ca. 1/5 niedrigere mRNA-Expression als die L3 Larven aufweisen.
71

3.5.5 nhx-2
Mittlere normalisierte Expression
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
N2 L2
N2 L3
N2 L4
pep-2 L2
nhx-2 mRNA-Expressionsmuster
pep-2 L3
pep-2 L4
72
pep-2;daf-2 L2
pep-2;daf-2 L3
pep-2;daf-2 L4
pep-2;daf-2;daf-16 L2
pep-2;daf-2;daf-16 L3
pep-2;daf-2;daf-16 L4
Abb. 41: mRNA-Expressionsmuster für nhx-2 in den drei Larvenstadien L2, L3 und
L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16.
P (Signifikanz) < 0,005.
Das mRNA-Expressionsmuster für das Gen nhx-2 weist für den pep-2 und pep-2;daf-2
Knockout auffällige Effekte für die mRNA-Expression in den L2 Larven auf (Abb. 41).
Die Dreifachmutante zeigt deutliche Effekte in den L3 und L4 Larven. Der Wurmstamm
pep-2 besitzt in den L2 Larven eine gegenüber dem Wildtyp stark reduzierte mRNA-
Expression. Diese beträgt nur noch etwa 1/6 verglichen mit der mRNA-Expression in N2
Würmern. Ebenso trifft dies für die L2 Larven im Wurmstamm pep-2;daf-2 zu. Im
Wurmstamm pep-2;daf-2;daf-16 beobachtet man jedoch eine Annäherung der mRNA-
Expression in L2 Larven an das Level der mRNA-Expression im Wildtyp. Der Unterschied
zur Wildtypexpression beläuft sich ca. auf 1/3. Vergleicht man die mRNA-
Expressionslevel der L3 Larven, ergibt sich für den Wurmstamm pep-2 eine Reduktion der
mRNA-Expression um 1/3 und in den pep-2;daf-2 Larven ist die mRNA-Expression gleich
der mRNA-Expression im Wildtyp. Dagegen steigt die mRNA-Expression in den L3
Larven des Stammes pep-2;daf-2;daf-16 fast auf das Doppelte an. Des weiteren beobachtet

man für das Larvenstadium L4 eine Zunahme der mRNA-Expression im Wurmstamm pep-
2 um 1/3 verglichen mit der mRNA-Expression im Wildtyp. Die Würmer des
Wurmstammes pep-2;daf-2 zeigen eine Erniedrigung der mRNA-Expression unter das
Wildtyplevel auf ca. 2/3. Indessen steigt aber in den L4 Larven des pep-2;daf-2;daf-16
Stammes die mRNA-Expression auf einen Wert, welcher doppelt so hoch ist wie beim
Wildtypstamm.
Der Vergleich der einzelnen Larvenstadien ergibt für die drei Knockoutstämme den
niedrigsten mRNA-Expressionswert jeweils in den L2 Larven. Im Wildtypstamm sind die
mRNA-Expressionslevel der L2 und L3 Larven fast identisch und unterscheiden sich vom
L4 Larvenstadium um etwa 1/3. Im Wurmstamm pep-2 nimmt die mRNA-Expression vom
Larvenstadium L2 über die L3 Larven zu den L4 Larven hin zu. Dabei steigt die mRNA-
Expression zunächst auf das Vierfache und anschließend in den L4 Larven auf das
Sechsfache an. Für die L2 und L3 Larven trifft dies auch auf den Wurmstamm pep-2;daf-2
zu. Jedoch fällt die mRNA-Expression in den L4 Larven auf die Hälfte der mRNA-
Expression in den L3 Larven ab. In den L3 Larven des Stammes pep-2;daf-2;daf-16 nimmt
die mRNA-Expression gegenüber der mRNA-Expression in den L2 Larven um fast das
Dreifache zu. In den L4 Larven sinkt die mRNA-Expression wieder um etwa 1/5.
3.5.6 Zusammenfassung der Ergebnisse
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass im Durchschnitt die mRNA-Expression im
Wurmstamm pep-2 verglichen mit der mRNA-Expression der anderen Stämme die
niedrigsten Werte für alle Gene annimmt. Eine Ausnahme bildet dabei die mRNA-
Expression der Gene aat-2, atg-2 und nhx-2. Zudem sind die Effekte, die man in den
einzelnen Larvenstadien dieses Stammes beobachtet, für die meisten Gene, abgesehen von
aat-2, nhx-2, atg-2 und T27A1.5, weniger stark ausgeprägt als in den anderen Stämmen.
D.h. die mRNA-Expressionen innerhalb dieses Wurmstammes sind annähernd gleich. Die
höchste mRNA-Expression der untersuchten Gene findet man in den meisten Fällen im
Wurmstamm pep-2;daf-2;daf-16. Dies trifft jedoch nicht für die Gene aat-1, aat-3 und aat-
9 zu. Darüber hinaus fallen die sehr niedrigen mRNA-Expressionslevel der Gene aat-4, -5,
-6, -8 und atg-1 auf. Für aat-4 und aat-8 liegt die mRNA-Expression unter einem Wert von
0,1 für die mittlere normalisierte mRNA-Expression (Abb. 31, 34). aat-5, -6 und atg-1
besitzen einen Wert für die mittlere normalisierte mRNA-Expression unterhalb von 1
(Abb. 32, 33, 36). Weiter sticht hervor, dass die mRNA-Expression für atg-1 sehr viel
73

geringer ist als die für atg-2. Dabei entspricht der mRNA-Expressionslevel von atg-1 etwa
dem mRNA-Expressionslevel der Gene aat-4, aat-5, aat-6 und aat-8. Der mittlere mRNA-
Expressionslevel von atg-2 liegt etwa in der Größenordnung der mRNA-Expression der
Gene aat-1, aat-2, aat-3 und aat-9. Im Vergleich der mRNA-Expression in den einzelnen
Larvenstadien innerhalb eines Wurmstammes beobachtet man für die Gene aat-1, aat-2,
aat-9, atg-1, atg-2, gcs-1, nhx-2, Y43F4B.7 und T27A1.5 sehr oft innerhalb der L3 Larven
die höchste mRNA-Expressionsrate. Dagegen zeigt das mRNA-Expressionsmuster des
Gens aat-3 eine Abnahme der mRNA-Expression vom Larvenstadium L2 hin zum
Larvenstadium L4 in allen untersuchten Wurmstämmen. Die Gene aat-3 und aat-9 weisen
für die Stämme N2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16 ähnliche mRNA-Expressionslevel
auf. Lediglich die mRNA-Expression in pep-2 ist deutlich erniedrigt. Die mRNA-
Expression der Gene aat-5 und aat-6 steigt beide Male im Wurmstamm pep-2;daf-2;daf-
16 stark an.
Die lysosomalen Aminosäuretransporter unterscheiden sich in ihren mRNA-
Expressionsleveln dahingehend, das T27A1.5 eine doppelt so hohe mRNA-Expression
aufweist wie Y43F4B.7. Zudem sind deutlichere Unterschiede in der mRNA-Expression
zwischen den untersuchten Wurmstämmen für das Gen T27A1.5 zu erkennen. Hier
erreicht die mRNA-Expression im Stamm pep-2;daf-2;daf-16 wieder etwa das
Wildtyplevel, während in den Stämmen pep-2 und pep-2;daf-2 die mRNA-Expression
niedriger ist.
Die mRNA-Expression des Gens gcs-1 ist gegenüber dem Wildtyp in den Wurmstämmen
pep-2 und pep-2;daf-2 erniedrigt, erreicht aber im Stamm pep-2;daf-2;daf-16 wieder das
mRNA-Expressionslevel des Wildtyps und übertrifft dieses sogar in den L3 und L4
Larven. Die mRNA-Expression ist auch bereits im Stamm pep-2;daf-2 höher als in der
Einzelmutante pep-2.
Betrachtet man das mRNA-Expressionsmuster des Gens nhx-2, fällt auf, dass die mRNA-
Expression im Larvenstadium L2 für alle drei Knockoutstämme sehr niedrig ist. Dabei
nimmt die mRNA-Expression in den L2 und L3 Larven vom Wurmstamm pep-2 über den
Stamm pep-2;daf-2 zum Stamm pep-2;daf-2;daf-16 hin zu.
74

4 Diskussion
Der Transport von Peptiden über die Zellmembran wird in allen Organismen von
spezifischen integralen Zellmembrantransportern vermittelt. In C. elegans kodiert das Gen
pep-2 für einen Peptidtransporter, welcher für die Aufnahme von Di- und Tripeptide aus
dem Darm in die intestinalen Epithelzellen ausschlaggebend ist. PEP-2 ist äußerst
bedeutend für die Aminosäureversorgung des Organismus. Dieser intestinale
Peptidtansporter spielt eine sehr wichtige Rolle bei der Bereitstellung von Aminosäuren für
Wachstum, Entwicklung und Reproduktion. Darüber hinaus besteht eine enge Verbindung
des Aminosäurestoffwechsels mit dem DAF-2/Insulin/IGF-Signaltransduktionsweg und
somit mit der Toleranz gegen oxidativen Stress und Alterungsprozessen [34, 35].
Ziel dieser Arbeit ist es zum einen festzustellen, über welche Kompensationsmechanismen
die fehlende Aufnahme von Peptiden, aufgrund des Verlustes des PEP-2
Peptidtransporters, auf molekularer Ebene ausgeglichen werden kann. Dazu werden die
mRNA-Expressionsmuster der Gene, die für die Komponenten verschiedener heteromerer
Aminosäuretransporter kodieren (aat-1, -2, -3, -4, -5, -6, -8, -9; atg-1, -2) und die mRNA-
Expressionsmuster der lysosomalen Aminosäuretransporterhomologen T27A1.5 und
Y43F4B.7 in C. elegans untersucht. Letztere wurden deshalb untersucht, da der
Verringerung der Aminosäurezufuhr von Außen eine effektivere Wiederverwertung bereits
intrazellulär vorhandener Aminosäurebestände gegenüberstehen könnte, die durch eine
erhöhte Ausschleusung von Aminosäuren aus dem Lysosom über die lysosomalen
Aminosäuretransporterhomologe vermittelt werden könnte. Mit der Analyse der
entsprechenden Gene in den unterschiedlichen verwendeten Knockoutstämmen wurde
beabsichtigt eventuelle Zusammenhänge dieser Kompensationsmechanismen mit dem
TOR bzw. dem DAF-2/Insulin/IGF-ähnlichen Signalweg aufzuklären. Von diesen beiden
Signalwegen ist bereits bekannt, dass sie einen Einfluss auf die PEP-2-Funktion besitzen
[35].
Zum anderen weisen die Würmer der drei Knockoutstämme eine erhöhte Resistenz
gegenüber oxidativen Stress auf [34, 35]. Dieses Phänomen sollte durch die Untersuchung
der mRNA-Expression des gcs-1 Gens näher beleuchtet werden. Es sollte aufgeklärt
werden, ob eine höhere mRNA-Expression dieses Gens, welches eine Schlüsselrolle in der
Glutathionneusynthese spielt, zu der erhöhten Resistenz führt [59]. Des weiteren ist
bekannt, dass Lysosomen ebenfalls am Schutz der Zellen gegen oxidativen Stress beteiligt
75

sind [36]. Das mRNA-Expressionsmuster der lysosmalen Aminosäuretransporterhomologe
T27A1.5 und Y43F4B.7 könnte auch hier einen Hinweis geben, worauf die erhöhte
Stressresistenz und die in den pep-2;daf-2 Würmern beobachtete Langlebigkeit beruht.
Zusätzlich wurde untersucht, wie sich der Knockout von pep-2 auf die mRNA-Expression
von nhx-2 auswirkt. nhx-2 kodiert für einen Na + /H + -Austauscher, für den bereits eine enge
funktionelle Kopplung mit PEP-2 nachgewiesen werden konnte [41].
4.1 mRNA-Expression in pep-2 Knockoutstämmen
Die Proteinbiosynthese spiegelt sich in der mRNA-Expression wieder. Ein hohes Maß an
Proteinneusynthese kann effektiv vorangetrieben werden, wenn die entsprechenden
mRNAs in der Zelle vorliegen. Gleichzeitig müssen dem Organismus ausreichend
Aminosäuren als Bausteine für die Proteine zur Verfügung stehen. Durch den Mangel an
intrazellulären Aminosäuren, wie er in Folge des pep-2 Knockouts vorliegt, wird die
Aktivität des TOR-Signalweges reduziert, welcher die Aktivierung der Transkription und
Translation, die Proteinbiosynthese und Proteindegradation reguliert [35].
Abb. 42: Detektion des Nährstoffstatus über den TOR-Signaltransduktionsweg und dessen
Einfluss auf die Proteinbiosynthese und –degradation in C. elegans [21].
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Die daraus resultierende Verringerung der mRNA-Expression könnte eine mögliche
Erklärung für die niedrigen Expressionslevel für die meisten untersuchten Gene im
Wurmstamm pep-2 sein (z. B. Abb. 28, 30, 35, 40). Der Zelle stehen nicht ausreichend
Aminosäuren zur Verfügung, um im hohe Maße weiterhin eine Proteinneusynthese
durchführen zu können. Daraus kann man schließen, dass die Zelle ihre mRNA-Expression
auf ein vertretbares Maß drosselt, um auf den Mangel an Aminosäuren zu reagieren.
Zudem könnte die beobachtete geringere Menge an Proteincarbonylen auf eine gesteigerte
Proteinstabilität hinweisen, wodurch eine Neusynthese auch vermindert werden könnte
[34]. Die Tatsache, dass die Unterschiede zwischen den einzelnen Larvenstadien im pep-2
Knockoutstamm oft geringer ausfallen, spricht dafür, dass sich die Zelle an einen geringen
Grundumsatz anpasst (Abb. 28). Diese Schlussfolgerungen stimmen auch mit der
Beobachtung überein, dass die Würmer dieses Stammes ein verlangsamtes Wachstum und
eine reduzierte Nachkommenzahl aufweisen [35].
Es konnte jedoch unter den untersuchten heteromeren Aminosäuretransportern auf mRNA-
Ebene keiner ausgemacht werden, der durch eine verstärkte Expression den intrazellulären
Aminosäuremangel in Folge des pep-2 Knockouts kompensieren und die beobachtete
Erhöhung der Aufnahme neutraler Aminosäuren [Spanier, unveröffentlichte Daten]
bewirken könnte. Jedoch kann vermutet werden, dass im pep-2 Knockoutstamm die
mRNA- und/oder die Proteinstabilität erhöht ist, wodurch weder eine Steigerung der
mRNA-Expression, noch der Proteinneusynthese, und damit ebenfalls der mRNA-
Expression erforderlich wäre. Die erhöhte Proteinstabilität könnte auf die verzögerte
Bildung von Proteincarbonyl in diesem C. elegans Stamm zurückzuführen sein [34].
Deshalb ist es sinnvoll die Untersuchungen auch auf Proteinebene und auf die Ermittlung
der Transporteffektivität der Aminosäuretransporter auszuweiten.
Des weiteren konnte gezeigt werden, dass vor allem im L3 Larvenstadium die höchsten
mRNA-Expressionswerte im Vergleich aller Wurmstämme und Larvenstadien erreicht
werden (siehe dazu Abb. 28, 29, 38 und 41). Nur in den L2 Larven des Wildtypstammes
konnte eine höhere mRNA-Expression mit einem Wert von 3,33 ± 0,19 für das Gen atg-2
gefunden werden (Abb. 37). Darüber hinaus besitzen fast alle Gene, abgesehen von aat-3,
aat-8 und atg-2 (siehe Abb. 30, 34, 37), in den L3 Larven die höchsten mRNA-
Expressionen. Die Ursache dafür könnte darin liegen, dass im L3 Larvenstadium
möglicherweise eine hohe Stoffwechselrate in Folge der Vorbereitung des
Wurmstoffwechsels auf die reproduktive Phase vorherrscht [13, 16, 32].
77

Im Dreifachmutantenstamm pep-2;daf-2;daf-16 wurden die höchsten mRNA-
Expressionslevel für die meisten Gene gefunden. Vermutlich hängt dies damit zusammen,
dass diese Würmer mit einer Summe an Defekt zurechtkommen müssen, da hier zwei
wichtige Signalwege stark beeinträchtigt sind. Durch den pep-2 Knockout wird der TOR-
Signalweg weniger stark stimuliert, wodurch die Proteinbiosynthese abnimmt [35].
Zusätzlich dazu wird die DAF-16-Funktion ausgeschaltet, welche Einfluss auf die mRNA-
Expression von Genen ausübt, welche an Prozessen beteiligt sind, die mit der Entwicklung,
Alterung, Antwort auf oxidativen Stress und Metabolismus zusammenhängen [13, 28, 49].
Demnach könnte es sein, dass der Wurm versucht alles zu mobilisieren, um diese Defekte
zu kompensieren und dazu seine Stoffwechselrate erhöht. Womöglich ist auch die
Proteinstabilität verringert, wodurch eventuell die mRNA-Expression ansteigt.
Auffällig ist, dass die Gene aat-1, aat-3 und aat-9 weniger betroffen sind (Abb. 28, 30,
35). Von aat-1 ist bekannt, dass es vom Transkriptionsfaktor DAF-16 abhängig ist [29].
Wenn daf-16 deletiert ist, findet eine signifikant geringere aat-1 mRNA-Expression im
Vergleich zum Wildtypstamm und vor allem zum pep-2;daf-2 Stamm statt (siehe Abb. 28).
Damit konnte die transkriptionelle Abhängikeit des aat-1 Gens vom DAF-16
Transkriptionsfaktor eindeutig nachgewiesen werden. Bei den beiden anderen Genen
nimmt im Dreifachmutantenstamm auch deren mRNA-Expression gegenüber dem Wildtyp
ab, jedoch wurden bisher keine DAF-16-Konsensus-Sequenzen in den Promotoren dieser
Gene gefunden. Auch spricht die gegenüber dem Wildtypstamm nahezu unveränderte
mRNA-Expression im pep-2;daf-2 Wurmstamm gegen eine DAF-16-Abhängigkeit dieser
Gen.
4.2 Effekte auf die mRNA-Expression der heteromeren Amino-
säuretransporter
Betrachtet man die mRNA-Expressionsmuster der schweren und leichten Untereinheiten
der heteromeren Aminosäuretransporter fällt sofort die Tatsache ins Auge, dass die Gene
der leichten Untereinheit aat-4, -5, -6, -8 und das Gen der schweren Untereinheit atg-1
sehr viel schwächer exprimiert werden, als die übrigen untersuchten Gene. Dies erklärt
möglicherweise auch die Ergebnisse früherer Experimente, in denen nachgewiesen werden
konnte, dass ATG-1 nicht mit den leichten Untereinheiten AAT-1, AAT-3 und AAT-9
interagiert [54]. Es ist denkbar, dass ATG-1 bevorzugt mit den schwächer exprimierten
Untereinheiten AAT-4, AAT-5, AAT-6 und AAT-8 wechselwirkt. Womöglich werden
78

diese C. elegans Gene nur in wenigen Zellen und Geweben exprimiert. Dafür würde auch
die Homologie zu heteromeren Aminosäuretransportern sprechen, die im Säugetier in
Neuronen und in Geweben wie dem Gehirn vorkommen. So sind AAT-4 und AAT-5
homolog zu y + LAT2 und AAT-8 zu ASC1, welche in Neuronen und im Gehirn lokalisiert
sind (siehe Tabelle 1, Punkt 1.3.2).
Die beiden Aminosäuretransporter AAT-5 und AAT-6 zeigen eine Homologie zu
Cystin/Glutamat-Transportern des x - c Systems, welches eine wichtige Rolle bei der
Bereitstellung von Cystin für die Zelle spielt und damit bei der Antwort der Zellen auf
oxidativen Stress [56]. Sowohl bei aat-5 als auch bei aat-6 steigt die mRNA-Expression im
Wurmstamm pep-2;daf-2;daf-16 auf über das zehnfache in den L3 Larven an. Dies könnte
eine Reaktion auf die Zunahme an Radikalen in diesem Wurmstamm sein, die durch das
Fehlen von DAF-16 induziert werden. Dieser ist für die Regulation der Transkription
mehrere Gene zuständig, die antioxidative Proteine, wie Katalasen, Superoxiddismutasen,
FK506-bindende Proteine, nukleoläres Phosphoprotein, Transmembrantyrosinkinasen,
Metallothioneine, Hitzeschockproteine kodieren [21]. Aufgrund der sehr geringen mRNA-
Expressionslevel werden die Ergebnisse zu den Genen aat-4, aat-5, aat-6, aat-8 und atg-1
nicht mehr genauer diskutiert, da es sich nur um Spekulationen handeln könnte. Es soll im
Folgenden genauer auf die Gene der vier anderen heteromeren
Aminosäuretransporteruntereinheiten (aat-1, -2, -3 und -9) und die schwere Untereinheit
atg-2 eingegangen werden.
4.2.1 Effekte auf die mRNA-Expression des heteromeren Amino-
säuretransporters AAT-1
Im Promotor des Gens für aat-1 wurde eine Konsensussequenz für den
Transkriptionsfaktor DAF-16 nachgewiesen [29]. Eine DAF-16 Abhängigkeit von aat-1
wird auch durch die hier durchgeführte Untersuchung bestätigt. So steigt die mRNA-
Expression dieses Gens im Wurmstamm pep-2;daf-2 stark in allen Larvenstadien an. Für
die L2 Larven steigt die mRNA-Expression gegenüber dem Wildtyp von einem Wert von
0,84 ± 0,07 auf einen Wert von 1,88 ± 0,05. In den L3 Larven nimmt die mRNA-
Expression von 1,46 ± 0,07 auf 2,96 ± 0,09 und in den L4 Larven von 0,71 ± 0,02 auf 2,62
± 0,39 zu (Abb. 28). Die durch den daf-2 Knockout bedingte erhöhte DAF-16
Konzentration im Nukleus führt zu einer verstärkten Expression DAF-16 abhängiger Gene
und somit auch zu einer erhöhten aat-1 mRNA-Expression. Die Tatsache, dass dieser
79

Effekt wieder aufgehoben wird, wenn ein DAF-16 Knockout im Wurmstamm pep-2;
daf-2;daf-16 eingeführt wird, belegt diese Annahme zusätzlich (L2: 0,64 ± 0,05; L3: 0,92
± 0,02; L4: 1,08 ± 0,04; Abb. 28). Somit konnte in dieser Arbeit ein eindeutiger Beweis
dafür erbracht werden, dass aat-1 von der DAF-16-Funktion abhängig ist.
4.2.2 Effekte auf die mRNA-Expression des heteromeren Amino-
säuretransporters AAT-2
Das Gen aat-2 weist eine Reduktion der mRNA-Expression im Wurmstamm pep-2;daf-2
(L2: 0,45 ± 0,08; L3: 0,33 ± 0,03; L4: 0,27 ± 0,02) gegenüber dem Wildtyp (L2: 0,87 ±
0,08; L3: 0,97 ± 0,03; L4: 0,45 ± 0,02) auf und gleichzeitig eine vor allem in den L3
Larven auftretende drastische Steigerung der mRNA-Expression im Stamm pep-2;daf-
2;daf-16 (L3: 2,98 ± 0,06) (Abb. 29). AAT-2 stellt ein Homolog zum LAT1 Protein aus
Ratte dar und besitzt eine Proteinkinase C-abhängige Phosphorylierungsstelle [47, 66].
Ebenfalls in Ratte wurde gezeigt, dass PDK1 die Proteinkinase C (PKC) aktiviert [27].
Auch im DAF-2/Insulin/IGF-Signaltransduktionsweg in C. elegans spielt PDK1 eine
wichtige Rolle (Abb. 6). Des weiteren wurde für das humane LAT1 gezeigt, dass die
Stimulierung der Proteinkinase C zur Erhöhung der mRNA-Expression von hLAT1 und
4F2hc führt [42]. PKC reguliert damit die Aktivität von hLAT1 und 4F2hc sowohl über
Phosphorylierung als auch über die Beeinflussung der mRNA-Expression. Möglicherweise
wirkt sich die fehlende Phosphorylierung der Proteinkinase C durch die PDK1 in Folge des
daf-2 Knockouts auf die Transkription von aat-2 aus. PKC ist weniger aktiv und somit
nimmt auch die mRNA-Expression von aat-2 im Wurmstamm pep-2;daf-2 ab. Die starke
Zunahme im Dreifachmutantenstamm kann eventuell mit den unter Punkt 4.1 angestellten
Überlegungen erklärt werden. Dass die Summe an Defekten den Wurm zur Mobilisation
seiner Reserven veranlasst. Es ist aber auch denkbar, dass AAT-2 im pep-2;daf-2;daf-16
Wurmstamm eine untergeordnete Rolle für die Versorgung des Organismus mit
Aminosäuren spielt und deshalb die mRNA-Expression verringert ist. Womöglich hat auch
die geringere Proteinalterung dieses Stammes einen Einfluss auf die mRNA-Expression, da
dadurch kaum oder keine Neusynthese nötig ist [34]. Jedoch müsste hier ein ähnlicher
Effekt auch für die mRNA-Expression der anderen untersuchten Gene vorhanden sein.
Dort findet man keine so deutlich Abnahme der mRNA-Expression wie für das Gen aat-2,
jedoch liegt die mRNA-Expression meist etwa auf Wildtyplevel oder darunter, außer bei
aat-1 (Abb. 28). Demnach ist es zumindest denkbar, dass eine erhöhte Proteinstabilität in
80

diesem Knockoutstamm keine Steigerung der mRNA-Expression über Wildtyplevel
erforderlich macht.
4.2.3 Effekte auf die mRNA-Expression des heteromeren Amino-
säuretransporters AAT-3
Das mRNA-Expressionsmuster für das Gen aat-3 zeigt, dass im Gegensatz zu aat-1 für
aat-3 kein DAF-16 abhängiger Effekt zu erkennen ist (Abb. 30). Wieder ist hier nur eine
erniedrigte mRNA-Expression im pep-2 Stamm sichtbar, wohingegen die mRNA-
Expression im pep-2;daf-2 (L2: 1,83 ± 0,15; L3: 1,3 ± 0,06; L4: 0,81 ± 0,1) und im pep-
2;daf-2;daf-16 (L2: 1,22 ± 0,09; L3: 1,21 ± 0,03; L4: 0,77 ± 0,03) Wurmstamm sich
weniger stark vom Wildtyp (L2: 2,09 ± 0,18; L3: 1,42 ± 0,22; L4: 0,48 ± 0,07)
unterscheiden. Demnach besteht für das Gen aat-3 keine DAF-16-Abhängigkeit. Dies wird
auch durch die Tatsache bekräftigt, dass für dieses Gen bisher keine DAF-16
Konsensussequenz im Promotor entdeckt wurde [27]. Darüber hinaus ist jedoch ein
entwicklungsabhängiger Effekt erkennbar, da in allen Wurmstämmen die mRNA-
Expression von den L2 Larven über die L3 Larven zu den L4 Larven hin abnimmt. Dies
könnte ein Hinweis drauf sein, dass dieser Aminosäuretransporter an Bedeutung in den
älteren Würmernverliert.
4.2.4 Effekte auf die mRNA-Expression des heteromeren Amino-
säuretransporters AAT-9
Das Gen aat-9 besitzt ein mRNA-Expressionsmuster, welches keine eindeutigen Effekte
des pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16 Knockouts widerspiegelt (Abb. 35). Der einfache
pep-2 Knockout lässt wiederum die zuvor beschriebene Abnahme der mRNA-Expression
erkennen (L2: 0,17 ± 0,02; L3: 0,25 ± 0,01; L4: 0,33 ± 0,01), welche mit der stark
verminderten Proteinbiosynthese erklärt wird. In den anderen beiden Knockoutstämmen
nimmt nur in den L3 Larven die mRNA-Expression im Vergleich zum Wildtyp ab,
wohingegen für die L2 und L4 Larven kaum ein Unterschied erkennbar ist (Wildtyp: L2:
0,57 ± 0,05; L4: 0,54 ± 0,01; pep-2;daf-2: L2: 0,57 ± 0,02; L4: 0,55 ± 0,03; pep-2;daf-
2;daf-16: L2: 0,43 ± 0,03; L4: 0,57 ± 0,02). Dabei besitzt die mRNA-Expression in den L3
Larven des pep-2;daf-2 Wurmstammes einen Wert von 0,74 ± 0,03 und im Wurmstamm
81

pep-2;daf-2;daf-16 0,61 ± 0,04 gegenüber einem Wert von 1,13 ± 0,05 im Wildtypstamm
(Abb. 35). Vermutlich haben die beiden Signaltransduktionswege TOR und DAF-
2/Insulin/IGF keinen großen Einfluss auf diesen Aminosäuretransporter, der verstärkt in
den Neuronen lokalisiert ist und dort die Zellantwort auf die Aminosäureversorgung nicht
beeinflusst.
4.2.5 Effekte auf die mRNA-Expression der schweren Untereinheit
ATG-2 der heteromeren Aminosäuretransporter
Das mRNA-Expressionslevel des Gens atg-2 der zweiten schweren Untereinheit, welche in
der vorliegenden Arbeit untersucht wurde, entspricht größenordnungsmäßig dem mRNA-
Expressionslevel der Gene der leichten Untereinheiten der heteromeren
Aminosäuretransporter AAT-1, AAT-3 und AAT-9 (Abb. 37). Dieses Ergebnis korreliert
mit dem Ergebnis anderer Untersuchungen, die zeigen, dass die Aminosäuretransporter
AAT-1 und AAT–3 kovalent und AAT-9 nicht-kovalent mit der schweren Untereinheit
ATG-2, aber nicht mit ATG-1 interagieren [53, 54]. Dabei ist ATG-2 für den Transport des
Aminosäuretransporter-Komplexes an die Zelloberfläche zuständig [54]. Dieser Befund
bekräftigt auf dem mRNA-Level diese früheren Erkenntnisse.
Es konnte auch hier kein DAF-16-abhängiger Effekt beobachtet werden. Auch ist keine
deutlich erhöhte mRNA-Expression dieser Untereinheit erkennbar, wodurch die
Lokalisation der leichten Untereinheiten der heteromeren Aminosäuretransporter an der
Zelloberfläche gefördert werden könnte, welche als Kompensationsreaktion auf den
Aminosäuremangel gedeutet werden könnte. Die stark erhöhte mRNA-Expression in den
L2 Larven des Wildtypstammes (3,33 ± 0,2) lässt sich in dieser Arbeit in keinen
Zusammenhang bringen.
4.3 Effekte auf die mRNA-Expression lysosomaler Amino-
säuretransporterhomologe
Bei der Betrachtung der mRNA-Expressionsmuster der beiden untersuchten lysosomalen
Aminosäuretransporterhomologe fällt zunächst auf, dass das Gen Y43F4B.7 (Wildtyp: L2:
1,13 ± 0,1; L3: 1,06 ± 0,02; L4: 0,55 ± 0,01; Abb.39) etwa halb so stark exprimiert wird,
wie das Gen T27A1.5 (Wildtyp: L2: 2,27 ± 0,24; L3: 2,14 ± 0,11; L4: 1,32 ± 0,06; Abb.
82

38). Auch ist das Grundexpressionslevel des letztgenannten Gens im Vergleich zu den
anderen untersuchten Genen sehr hoch (siehe Wildtypexpression, oben). Somit scheint,
dass dieses Aminosäuretransporterhomolog in den Lysosomen vieler Zellen und Gewebe
exprimiert wird. Im Wurmstamm pep-2;daf-2 ist die Hemmung des DAF-16
Transkriptionsfaktors aufgehoben. Die antioxidativen Effekte der DAF-16 Funktion liegen
in der Regulation der Transkription mehrerer Gene, die antioxidative Proteine, wie
Katalasen, Superoxiddismutasen, FK506-bindende Proteine, nukleoläres Phosphoprotein,
Transmembrantyroinkinasen, Metallothioneine, Hitzeschockproteine kodieren [21]. Zum
Beispiel sind Superoxiddismutasen dafür verantwortlich aus dem Superoxid-Radikal das
nichtradikalische Wasserstoffperoxid zu bilden, welches wiederum durch Katalasen zu
Wasser reduziert werden kann [31]. Der Mechanismus zum Schutz der Zellen gegen
oxidativen Stress ist in diesem Wurmstamm vollständig aktiviert, wodurch die Menge an
geschädigten Proteinen in Folge von Radikaleinwirkung möglicherweise abnimmt. Dies
führt zu einem geringern Anteil an Proteincarbonylen [35]. In Dreissena polymorpha
konnte eine Abhängigkeit der Lysosomenzahl und –größe von der Cadmiumkonzentration
nachgewiesen werden [19]. Dabei vermittelt Cadmium auch oxidativen Stress [50]. Auch
bei Gentamicin-induziertem oxidativen Stress wurde eine Zunahme der Lysosomenzahl
und des Lysosomenvolumens in Haarzellen der Chochlea in Meerschweinchen gezeigt
[20]. Deshalb könnte man darauf schließen, dass die Lysosomenzahl entsprechend der
Belastung durch geschädigte Proteine variiert. Es ist aber auch denkbar, dass die
Transporteranzahl an der Lysosomenmembran aufgrund der Zunahme der
Lysosomengröße [19, 20] beeinflusst wird. So kann womöglich die geringere Menge an
wiederzuverwertendem Protein im pep-2;daf-2 Stamm der Grund für die Abnahme der
mRNA-Expression eines lysosomalen Transporters sein. Weiter ist zu beobachten, dass
T27A1.5 in den L3 und L4 Larven des Wurmstammes pep-2;daf-2;daf-16 (L3: 2,75 ±
0,01; L4: 2,35 ± 0,09) eine gegenüber dem Wildtyp (L3: 2,14 ± 0,11; L4: 1,32 ± 0,06)
erhöhte mRNA-Expression aufweist (Abb. 38). Dies hängt vermutlich damit zusammen,
dass durch den Verlust des daf-16 Gens eine wichtige Komponente für den Schutz der
Zellen gegen oxidativen Stress ausgeschaltet wurde. Dies führt zur verstärkten Bildung von
Radikalen und damit zur vermehrten Schädigung von Proteinen, welche über die
Lysosomen entfernt und recycelt werden, und deren Bestandteile wieder in die Zelle
ausgeschleust werden müssen. Um der erhöhten Menge der zu entsorgenden Proteine
gerecht werden zu können, könnte die Zelle zum einen die Anzahl an Lysosomen und zum
anderen die Menge an lysosomalen Transportern erhöhen, wie es in anderen Organismen
83

ereits beschrieben wurde [19, 20]. Darüber hinaus wurde eine Aktivierung der durch
Chaperone vermittelten Autophagie (CMA) bei oxidativen Stress beobachtet, wobei im
Gegensatz zur Autophagie in Folge eines Aminosäuremangels eine transkriptionelle
Hochregulierung des lysosomalen Membranproteins lamp2a in einer de novo Synthese
stattfindet [26]. Womöglich werden neben lamp2a auch andere lysosomale
Translokationskomplexe hochreguliert. So könnte in diesen Fällen auch die mRNA-
Expression der lysosomalen Transporter zunehmen. Dass dies aber nicht für alle
Transporter gelten muss, zeigt das mRNA-Expressionsmuster des anderen untersuchten
lysosomalen Aminosäuretransporterhomologs Y43F4B.7 (Abb. 39). Vermutlich ist dieses
Transporterhomolog weniger effektiv und könnte den effektiveren Transportern Platz
machen, da die Oberfläche der Lysosomen begrenzt ist.
Im pep-2 Stamm ist für die L3 Larven (L3: 1,26 ± 0,03) eine leichte Verminderung, bzw.
für L4 (L4: 1,4 ± 0,05), keine Verminderung der mRNA-Expression von T27A1.5
gegenüber dem Wildtypstamm (L3: 2,14 ± 0,11; L4: 1,32 ± 0,06) erkennbar. Womöglich
versucht die Zelle den Mangel an Peptiden, welche von Außen aufgenommen werden,
durch die Wiederverwertung bereits vorhandener, abgebauter Proteine zumindest teilweise
zu kompensieren. Auch hier hat der möglicherweise effektivere Aminosäuretransporter den
Vorrang. Darüber hinaus ist bekannt, dass der TOR-Signaltransduktionsweg in C. elegans
die Autophagie reguliert [23, 57]. Darunter versteht man den Proteinabbau und -umsatz
innerhalb lysosomaler Autophagosomen [57]. Es wurde beschrieben, dass ein niedriger
Aminosäurelevel zu einer verringerten Signalweiterleitung über den TOR-Signalweg führt,
woraufhin die Autophagie stimuliert wird [57]. Die Autophagie wird gezielt stimuliert,
wenn die Zelle nur wenig Nährstoffe zur Verfügung hat. Unbrauchbar gewordene Proteine,
Organellen und Zellbestandteile werden in ihre Einzelbestandteile zerlegt und wieder
verwertet [14]. Dies würde die Beobachtung der geringeren mRNA-Expressionsabnahme
für T27A1.5 erklären. Der PEP-2 Transporter übt einen wichtigen Einfluss auf den TOR-
Signaltransduktionsweg aus [35]. Bei einem Verlust dieses Signaltransduktionsweges
konnte das Vorkommen aufgebrochener Lysosomen beobachten werden [30]. Auch
deshalb könnte man auf die Bevorzugung der effektiveren lysosomalen Transporter
schließen, damit die wenigen intakten Lysosomen möglichst optimal arbeiten.
84

4.4 Effekte auf die mRNA-Expression der -Glutamylcystein
Synthetase GCS-1
In den untersuchten Knockoutstämmen wurde eine erhöhte Resistenz gegen oxidativen
Stress beobachtet [35]. Außerdem konnte im pep-2 Knockoutstamm ein erhöhter
Glutathionspiegel gemessen werden (Spanier, unveröffentlichte Daten). Zur Aufklärung
der Ursachen für die erhöhte Resistenz gegen oxidativen Stress, wurde das mRNA-
Expressionsmuster des Gens gcs-1 ermittelt. GCS-1 ist das Schlüsselenzym der
Glutathionneusynthese [59]. Bei Jia et al., 2004 wurde eine klare Hemmung von daf-15
(Raptor) durch DAF-16 nachgewiesen. Dort konnte gezeigt werden, dass in daf-2
Würmern kaum daf-15 mRNA vorlag, während in daf-16;daf-2 Würmern ein starker
Anstieg der daf-15 mRNA gezeigt werden konnte. Somit liegt hier ist ein klarer Beweis
dafür vor, dass die daf-15-Transkription durch DAF-16 gehemmt wird.
Abb. 43: Vermutete Interaktion zwischen dem DAF-2/Insulin/IGF-
Signaltransduktionsweg, TOR-Signaltransduktionsweg und der Nährstoffversorung in
C. elegans [21].
In vorliegender Untersuchung ist die mRNA-Expression in den L2 und L3 Larven des
Wurmstammes pep-2;daf-2 (L2: 0,85 ± 0,04 ; L3: 0,88 ± 0,08) im Vergleich zum Wildtyp
(L2: 1,56 ± 0,14; L3: 1,19 ± 0,02; L4: 0,58 ± 0,04) erniedrigt, aber im Wurmstamm pep-
85

2;daf-2;daf-16 für die L3 und L4 Larven (L3: 1,83 ± 0,08; L4: 1,34 ± 0,05) erhöht (Abb.
40). In der Ratte konnte zuvor eine Regulation der Glutathionbiosynthese über den Insulin-
und mTOR-Signaltransduktionsweg gezeigt werden [27]. Ein aktiver Insulin
Signaltransduktionsweg aktiviert mTOR, welches über die p70S6 Kinase die GSH-
Synthese stimuliert [27]. In C. elegans reguliert der CeTOR/DAF-15-Komplex
Metabolismus und Lebensdauer [23]. DAF-16 hemmt die daf-15 Transkription, welches
das Raptor-Ortholog in C. elegans kodiert [23]. Die Tatsache, dass ein aktiver
Transkriptionsfaktor DAF-16 im Wurmstamm pep-2;daf-2 zu einer Abnahme und der
Knockout von daf-16 im Stamm pep-2;daf-2;daf-16 zu einer Zunahme der gcs-1 mRNA-
Expression führt, bestärkt die Annahme, dass auch in C. elegans ein Zusammenhang
zwischen der Glutathionbiosynthese und dem TOR- und DAF-2/Insulin/IGF-
Signaltransduktionsweg besteht. Der aktive Transkriptionsfaktor DAF-16 hemmt den
DAF-15/CeTOR-Komplex und damit die über die S6 Kinase vermittelte Stimulierung der
Glutathionbiosynthese. Durch den Verlust von DAF-16 läuft der TOR-
Signaltransduktionsweg verstärkt ab, da daf-15 nicht mehr durch DAF-16 gehemmt ist und
die gcs-1 mRNA-Expression findet in einem erhöhten Maße statt. Darüber hinaus zeigt das
Ergebnis der verringerten gcs-1 mRNA-Expressionen in den Wurmstämmen pep-2 und
pep-2;daf-2, dass die erhöhte Resistenz gegenüber oxidativen Stress in diesen Stämmen
nicht auf eine Glutathionneusynthese zurückzuführen ist. Zudem handelt es sich bei diesen
Knockoutstämmen um Stämme in denen die Proteinbiosynthese aufgrund des
Peptidmangels heruntergefahren ist. Deshalb greifen die Zellen hier womöglich bevorzugt
auf Mechanismen für den Schutz gegen oxidativen Stress zurück, welche nicht über eine
Glutathionneusynthese wirken. Dazu gehören vermutlich die durch die vom DAF-16
Transkriptionsfaktor abhängigen Gene, welche für antioxidative Enzyme kodieren, wie
z.B. Katalsen (ctl-1, ctl-2) und Superoxidismutase (sod-3) [21].
4.5 Effekte auf die mRNA-Expression Na + /H + -Austauschers NHX-2
Aus früheren Untersuchungen ist bekannt, dass die Funktion des Peptidtransporter PEP-2
eng an die Funktion des Na + /H + -Austauschers NHX-2 gekoppelt ist. Darin wurde gezeigt,
dass PEP-2 NHX-2 benötigt, um optimal arbeiten zu können [41]. Die Aufnahme von Di-
und Tripeptiden hat eine Aufnahme von H + zur Folge, was zu einer Ansäuerung des
Zytoplasmas führt. Die Ansäuerung wird durch NHX-2 in einem elektroneutralen
Austausch von intrazellulärem H + gegen extrazelluläres Na + verhindert [57]. Des weiteren
86

konnte gefunden werden, dass der RNAi-induzierte Knockdown des nhx-2 Gens stärkere
Effekte (verzögerte Entwicklung, verringerte Körperlänge um etwa die Hälfte, verminderte
intestinale Fettspeicherung, leicht reduziertes Pumpen des Pharynx, annähernde
Unfruchtbarkeit und eine im ca. 40 % gesteigerte Lebensdauer) zu Folge hat, als der
RNAi-Knockdown des pep-2 Gens (verringertes Wachstum, verringerte Körperlänge,
verminderte Fruchtbarkeit und keine verlängerte Lebensdauer) [41]. Diese Beobachtung
lässt die Aussage zu, dass NHX-2 möglicherweise die Funktion von einer Vielzahl von
Transportern beeinflusst, wobei PEP-2 einen wichtigen Kandidaten darstellt. Der starke
Phänotyp, der durch den nhx-2-Knockdown ausgelöst wird, ähnelt zudem dem Phänotyp
bei kalorischer Restriktion, welche wahrscheinlich mit der weniger effektiven
Nährstoffaufnahme zusammenhängt [41, 57]. Dies wird dadurch bedingt, dass der nhx-2-
Knockdown dazu führt, dass PEP-2 und eventuell auch andere Nährstofftransporter nicht
mehr so effektiv arbeiten können. Somit nimmt vermutlich die Nährstoffzufuhr ab,
wodurch oben genannter Phänotyp entsteht.
In den L2 Larven des pep-2 Stammes nimmt die nhx-2 mRNA-Expression um das 6,7-
fache (0,19 ± 0,01), im pep-2;daf-2 Stamm um das 4,9-fache (0,26 ± 0,01) und im Stamm
pep-2;daf-2;daf-16 um das 1,4-fache (0,92 ± 0,07) verglichen mit dem Wildtyp ab (1,27 ±
0,13) (Abb. 41). Dieses Ergebnis und die Beobachtung, dass die nhx-2 mRNA-Expression
von den L2 Larven zu den L3 und L4 Larven zunimmt, ist möglicherweise auf die
verzögerte Entwicklung in den Knockoutstämmen zurückzuführen. Dafür spricht auch die
Tatsache, dass im Wildtypstamm keine entwicklungsabhängigen Effekte erkennbar sind.
Vermutlich ist auch der Stoffwechsel in den L2 Larven nicht sehr hoch, wodurch weniger
protonen-abhängige Prozesse ablaufen, welche womöglich im Zusammenhang mit einem
NHX-2 vermittelten Protonenaustausch stehen. Dass es vor allem in den L3 Larven der
Knockoutstämme zu diesem Schub der mRNA-Expression von nhx-2 kommt, kann
eventuell auch mit einer höheren Stoffwechselrate in diesem Larvenstadium erklärt werden
(siehe Punkt 4.1).
Das Ergebnis der Studie von McElwee et al. (2004) [33], dass der daf-2 Knockdown für
nhx-2 und pep-2 eine Reduktion der mRNA-Expression um das 5,6- bzw. 7,7-fache und
eine Abnahme um das 2- bzw. 3,7-fache in Dauerlarven gegenüber daf-2;daf-16 mit sich
bringt, konnte in der vorliegenden Studie bestätigt werden. Es konnte eine Abnahme der
mRNA-Expression des nhx-2 Gens im pep-2;daf-2 Stamm um das 3,5-fache in den L2
Larven, das 2,2-fache in den L3-Larven und das 3,3-fache in den L4 Larven im Vergleich
zu den entsprechenden Larvenstadien des pep-2;daf-2;daf-16 Stamms beobachtet werden.
87

So führt eine erhöhte DAF-16-Aktivität in beiden Studien zu einer eindeutigen Abnahme
der mRNA-Expression von nhx-2. Jedoch ist die Abnahme der mRNA-Expression von
nhx-2 im pep-2;daf-2 Knockouthintergrund schwächer als in den daf-2 Würmern. Dieser
Effekt ist vermutlich auf den geringeren Protoneninflux in die nhx-2 exprimierenden
Zellen zurückzuführen, die keinen funktionsfähigen PEP-2 Transporter enthalten.
Die Tatsache, dass in der Dreifachmutante pep-2;daf-2;daf-16 eine starke Zunahme der
nhx-2 mRNA-Expression stattfindet, spricht dafür, dass der komplette Verlust der DAF-16
Funktion durchaus eine Wirkung auf die nhx-2 Expression besitzt. Es handelt sich beim
DAF-2/Insulin/IGF Signaltransduktionsweg um eine wichtige Instanz, die bei vielen
Prozessen mitwirkt, von denen aber bei vielen die zugrundeliegenden Mechanismen noch
nicht geklärt sind. Da der Austausch von Protonen sowie der Aufbau/Abbau von
Protonengradienten auch an vielen Prozessen im Stoffwechsel beteiligt sind, kann hier auf
vielfache Weise ein Zusammenhang mit diesem Signaltransduktionsweg bestehen. Unter
Punkt 4.1 wurde bereits spekuliert, das der Wurmstamm pep-2;daf-2;daf-16
möglicherweise eine erhöhte Stoffwechselaktivität als Kompensation der großen Summe
an Defekten besitzt.
Abschließend sollte erwähnt werde, dass auf mRNA-Ebene sich nichts über die Effektivität
der Transporteraktivität oder der Stabilität der entsprechenden Proteine aussagen lässt.
Untersuchungen endogener mRNA-Expressionsmuster stellen ein wichtiges Werkzeug dar,
um Erkenntnisse über die durch gezielte Knockouts hervorgerufenen Effekte auf den
Organismus zu erhalten.
Jedoch sind die Aussagen über die Zusammenhängen der mRNA-Expressionsmustern der
einzelnen Gene in Folge des Knockouts mit den physiologischen Auswirkung, wie sie in
dieser Arbeit diskutiert wurden, immer vor dem Hintergrund zu betrachten, dass es sich
hier großteils nur um Spekulationen und Annahmen handeln kann. Über die tatsächliche
Bedeutung für den Organismus in diesen doch sehr komplexen Zusammenhängen könnten
durch Versuche auf Proteinebene zusätzliche Hinweise erhalten werden, welche weiter zur
Aufklärung beitragen. Somit ist es sinnvoll, dass den Untersuchungen auf mRNA-Ebene
Untersuchungen auf Proteinebene folgen sollten.
88

5 Zusammenfassung
In C. elegans kodiert das Gen pep-2 für einen Peptidtransporter, welcher als Homolog zum
mammalischen PEPT1 die Aufnahme von Di- und Tripeptide aus dem Darm in die intestinalen
Epithelzellen über einen protonen-gekoppelten Transport vermittelt. Dieser intestinale
Peptidtransporter spielt eine überaus wichtige Rolle bei der Bereitstellung von Aminosäuren
für Wachstum, Entwicklung und Reproduktion. Darüber hinaus besteht eine enge Verbindung
des Aminosäurestoffwechsels mit dem DAF-2/Insulin/IGF-Signaltransduktionsweg und somit
mit der Toleranz gegenüber oxidativen Stress und Alterungsprozessen [34, 35].
Mit dieser Arbeit wurde beabsichtigt eventuelle Kompensationsmechanismen (gesteigerte
Aufnahme neutraler Aminosäuren) für den intrazellulär entstandenen Aminosäuremangel und
die erhöhte Resistenz gegenüber oxidativen Stress im pep-2 Knockoutstamm auf mRNA-
Ebene mittels der real-time Lightcycler RT-PCR aufzuklären. Dazu wurden zum einen die
mRNA-Expressionsmuster ausgewählter heteromerer und lysosomaler Aminosäuretransporter
und zum anderen das mRNA-Expressionmuster des Schlüsselgens der Glutathionbiosynthese
ermittelt. Zusätzlich sollte noch abgeklärt werden, wie sich der pep-2 Knockout auf die
mRNA-Expression des Na + /H + -Austauscher NHX-2 auswirkt, welcher eine enge funktionelle
Kopplung zu PEP-2 besitzt. Neben dem pep-2(lg601) Knockoutstamm wurden noch zwei
weitere Wurmstämme untersucht, pep-2(lg601);daf-2(e1370) und pep-2(lg601);daf-
2(e1370);daf-16(m26), um Aussagen über eventuelle Einflüsse der beiden
Signaltransduktionswege TOR und DAF-2/Insulin/IGF treffen zu können. Es konnte unter den
untersuchten heteromeren Aminosäure-Transportern auf mRNA-Ebene keiner ausgemacht
werden, der durch eine verstärkte mRNA-Expression den intrazellulären Aminosäure-Mangel
in Folge des pep-2 Knockouts zu kompensieren scheint. Jedoch wurde auf mRNA-Ebene ein
Beweis erbracht, dass das Gen aat-1, welches für den heteromeren Aminosäuretransporter
AAT-1 kodiert, vom Transkriptionsfaktor DAF-16 abhängt. Man beobachtet eine deutliche
Steigerung der mRNA-Expression für aat-1, wenn DAF-16 voll aktiv vorliegt, während der
zusätzliche Knockout von daf-16 diese mRNA-Expressionssteigerung aufhebt. Darüber hinaus
scheint die erhöhte Resistenz gegenüber oxidativen Stress im pep-2 Stamm nicht auf eine
gesteigerte Glutathionneusynthese zurückzuführen zu sein, da in den Stämmen, welche die
erhöhte Resistenz gegenüber oxidativen Stress aufweisen, keine stärkere mRNA-Expression
für gcs-1 zu erkennen ist. Des weiteren sprechen einige Punkte dafür, das der lysosomale
Aminosäure-Transporterhomologe T27A1.5 an der Antwort der Zelle auf oxidativen Stress
beteiligt ist.
89

6 Summary
The C. elegans PEP-2, the homologue of the mammalian PEPT-1, encodes a peptide
transporter that mediates the uptake of di- and tripeptides from the gut lumen into intestinal
epithelial cells via a proton-coupled transport. This intestinal peptide transporter plays an
extremely important role in providing amino acids for growth, development and
reproduction. Moreover, it exists a close connection between amino acid metabolism,
DAF-2/insulin/IGF signal transduction pathway and the resistance of C. elegans against
oxidative stress and aging prozesses [34, 35].
In this study, it was intended to elucidate mechanisms, that possibly compensate (through
an increased uptake of neutral amino acids) the intracellular amino acid deficiency as a
result of the pep-2 knockout and the molecular mechanisms that induce resistance against
oxidative stress in pep-2 strains with regard to the mRNA levels using real-time
Lightcycler RT-PCR. This was achieved by determining mRNA expression patterns of
selected heteromeric and lysosomal amino acid transporter homologues and of the central
gene of the glutathione synthesis. Additionally, we intended to realize how the pep-2
knockout effects mRNA expression of the Na + /H + exchanger NHX-2, which shows a close
functional connection to PEP-2. Besides the pep-2(lg601) strain two additional C. elegans
strains have been examined, pep-2(lg601);daf-2(e1370) and pep-2(lg601);daf-
2(e1370);daf-16(m26), in order to give evidence about possible influences of both TOR
and DAF-2/Insulin/IGF signalling pathways.
However, regarding mRNA level it was not possible to identify a heteromeric amino acid
transporter that compensated the intracellular amino acid deficiency in pep-2(lg601) via an
increased mRNA expression. In addition, an evidence was provided regarding mRNA level
that the gene aat-1, which encodes the heteromeric amino acid transporter AAT-1, directly
depends on the transcription factor DAF-16. A clear increase of mRNA expression
concerning aat-1 was observed if DAF-16 was active, whereas the knockout of daf-16
neutralized this increase of mRNA expression. Moreover, it seems that the increased
resistance against oxidative stress in pep-2 knockout strains is not attributable to an
enhanced de nove glutathione synthesis, since there was no greater mRNA expression of
gcs-1 observed in those strains which show a higher resistance against oxidative stress.
Some indication was found that the lysosomal amino acid transporter T27A1.5 is involved
in the cellular response to oxidative stress.
90

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8 Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Rasterelektronenaufnahme eines Caenorhabditis elegans Hermaphroditen. ....... 5
Abb. 2: Morphologie von C. elegans. ................................................................................. 6
Abb. 3: Lebenszyklus von C. elegans. ................................................................................ 6
Abb. 4: Einfluss des Nährstoffstatus auf die Regulation der Proteinsynthese und
derProteindegradation............................................................................................9
Abb. 5: Interaktionen der verschiedenen Signalwege mit dem TOR Signalweg im
Säugetier und deren Auswirkung auf die eukaryotische Translations-
maschinerie. ........................................................................................................ 10
Abb. 6: Modell für den DAF-2/Insulin/IGF-Signalweg ................................................... 11
Abb. 7: Interaktionen des TOR-Signaltransduktionsweges und des DAF-2/Insulin/IGF-
Signal-transduktionsweges mit dem Peptidtransporter PEP-2 im C. elegans
Wildtypstamm......................................................................................................12
Abb. 8: Auswirkung der Interaktion des TOR-Signaltransduktionsweges und des DAF-
2/Insulin/ IGF-Signaltransduktionsweges mit dem Peptidtransporter PEP-2 in
C.. elegans vor dem Hintergrund eines pep-2 Knockouts. ................................. 13
Abb. 9: Auswirkungen der Interaktion des TOR-Signaltransduktionsweges und des DAF-
2/ Insulin/IGF-Signaltransduktionsweges mit dem Peptidtransporter PEP-2 in
C. elegans vor dem Hintergrund eines pep-2; daf-2 Knockouts......................... 14
Abb. 10: Stammbaum der heteromeren Aminosäuretransporter Typ II Glykoprotein-
untereinheiten aus Säugetier und C. elegans. ..................................................... 16
Abb. 11: Stammbaum der katalytischen Untereinheiten der Aminosäuretransporter aus
Mensch und C. elegans. ..................................................................................... 17
Abb. 12: Dendogramm der 13 Vertreter der AAAP-Familie in C. elegans und der vier
funktionell charakterisierten Vertreter aus dem Säugetier. ................................. 23
Abb. 13: Glutathionsynthese und dessen Nutzung in Tieren..............................................24
Abb. 14: Lokalisierung und Bestätigung der pep-2(lg601) Deletion in homozygoten Tieren
mittels PCR . ....................................................................................................... 34
Abb. 15: Die drei Schritte der Polymeras-Kettenreaktion. ................................................ 41
Abb. 16: Darstellung der unter Idealbedingungen ablaufende exponentiellen Zunahme der
Kopienzahl .......................................................................................................... 41
Abb. 17: Prinzip der SYBR Green Technik .................................................................... 42
97

Abb. 18: DNA-Agarosegel (1 %ig) zur Überprüfung des pep-2(lg601) Knockouts in den
C. elegans-Stämmen pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-16.......................48
Abb. 19: DNA-Agarosegel (1 %ig) der Produkte aus der PCR mit Primerpaar 1 zur
Identifizierung des pep-2 Mutantenallels in 15 gesingelten Würmern des
C. elegans-Stammes pep-2;daf-2;daf-16. ........................................................... 49
Abb. 20: DNA-Agarosegel (1 %ig) der Produkte aus der PCR mit Primerpaar 2 zur
Überprüfung der Homozygotie des pep-2 Knockouts in den 15 gesingelten
Würmern des C. elegans-Stammes pep-2;daf-2;daf-16. .................................... 50
Abb. 21: DNA-Agarosegel (1 %ig) der Produkte aus der PCR mit Primerpaar 2 zur
intensiveren Überprüfung der Kandidaten 5 und 6 des C. elegans-Stammes pep-
2;daf-2;daf-16 auf Homozygotie des pep-2 Knockouts.. .................................... 51
Abb. 22: RNA-Agarosegel zur Überprüfung der mRNA-Qualität für die nachfolgende
cDNA-Synthese. Aufgetragen wurde je 1 µg mRNA der drei Larvenstadien L2,
L3 und L4 des Stammes pep-2;daf-2. ................................................................. 52
Abb. 23: DNA-Agarosegel (1,5 %) für die Primeretablierung der Primerpaare zur
Amplifiktion der Gene aat-1, aat-3 und ama-1 für eine Annealing-Temperatur
von 62°C. ............................................................................................................ 53
Abb. 24: DNA-Agarosegel (2 %) für die Primeretablierung der Primerpaare zur
Amplifiktion der Gene aat-2, aat-8, aat-9, atg-1 und atg-2 für eine Annealing-
Temperatur von 62°C. ......................................................................................... 53
Abb. 25: DNA-Agarosegel (2 %) für die Primeretablierung der Primerpaare zur
Amplifiktion der Gene aat-4, aat-5, aat-6 und aat-7 für eine Annealing-
Temperatur von 62°C. ......................................................................................... 54
Abb. 26: DNA-Agarosegel (2 %) für die Primeretablierung des Primerpaares zur
Amplifiktion des Gens gcs-1 für eine Annealing-Temperatur von 62°C. ......... 54
Abb. 27: DNA-Agarosegel (2 %) für die Primeretablierung der Primerpaare zur
Amplifiktion der Gene T27A1.5, Y43F4B.7 und nhx-2 für eine Annealing-
Temperatur von 60°C. ......................................................................................... 54
Abb. 28: mRNA-Expressionsmuster für aat-1 in den drei Larvenstadien L2, L3
und L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-
16.........................................................................................................................56
Abb. 29: mRNA-Expressionsmuster für aat-2 in den drei Larvenstadien L2, L3
und L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-
16.........................................................................................................................57
98

Abb. 30: mRNA-Expressionsmuster für aat-3 in den drei Larvenstadien L2, L3
und L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-
16.........................................................................................................................59
Abb. 31: mRNA-Expressionsmuster für aat-4 in den drei Larvenstadien L2, L3
und L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-
16.........................................................................................................................60
Abb. 32: mRNA-Expressionsmuster für aat-5 in den drei Larvenstadien L2, L3
und L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-
16.........................................................................................................................61
Abb. 33: mRNA-Expressionsmuster für aat-6 in den drei Larvenstadien L2, L3
und L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-
16.........................................................................................................................62
Abb. 34: mRNA-Expressionsmuster für aat-8 in den drei Larvenstadien L2, L3
und L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-
16.........................................................................................................................63
Abb. 35: mRNA-Expressionsmuster für aat-9 in den drei Larvenstadien L2, L3
und L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-
16.........................................................................................................................64
Abb. 36: mRNA-Expressionsmuster für atg-1 in den drei Larvenstadien L2, L3
und L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-
16.........................................................................................................................65
Abb. 37: mRNA-Expressionsmuster für atg-2 in den drei Larvenstadien L2, L3
und L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-
16.........................................................................................................................66
Abb. 38: mRNA-Expressionsmuster für T27A1.5 in den drei Larvenstadien L2, L3
und L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-
16.........................................................................................................................67
Abb. 39: mRNA-Expressionsmuster für Y43F4B.7 in den drei Larvenstadien L2, L3
und L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-
16.........................................................................................................................69
Abb. 40: mRNA-Expressionsmuster für gcs-1 in den drei Larvenstadien L2, L3
und L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-
16.........................................................................................................................70
99

Abb. 41: mRNA-Expressionsmuster für nhx-2 in den drei Larvenstadien L2, L3
und L4 der C. elegans Stämme N2, pep-2, pep-2;daf-2 und pep-2;daf-2;daf-
16.........................................................................................................................72
Abb. 42: Detektion des Nährstoffstatus über den TOR-Signaltransduktionsweg und dessen
Einfluss auf die Proteinbiosynthese und –degradation in C. elegans ................. 76
Abb. 43: Vermutete Interaktion zwischen dem DAF-2/Insulin/IGF
Signaltransduktionsweg, TOR-Signaltransduktionsweg und der Nährstoff-
versorung in C. elegans ....................................................................................... 85
9 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Homologien der untersuchten C. elegans AATs zu einigen mHATs. ... ...18
Tabelle 2: Chemikalienliste..........................................................................................27
Tabelle 3: Geräteliste....................................................................................................31
Tabelle 4: Informationen zu den Primern der Zielgene................................................33
Tabelle 5: Informationen zu den Primern für die Identifizierung des Mutanten Allels
pep-2(lg601)...............................................................................................34
Tabelle 6: Programm für die Lightcycler Amplifikation..............................................43
100

10 Abkürzungsverzeichnis
AAAP Aminosäure/Auxin Permease (amino acid/auxin permease)
AAT Aminosäuretransporter (amino acid transporter)
Ala Alanin
ATG Aminosäuretransporter Typ II Glykoprotein Untereinheit
bp Basenpaar
BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)
cDNA komplementäre DNA
CDS kodierende DNA Sequenz
C. elegans Caenorhabditis elegans
CeTOR Caenorhabditis elegans TOR-Protein
CMA chaperone-mediated autophagy
CT Crossing Point
Cys Cystein
DAF abnormal dauer formation
DEPC Diethylpyrocarbonat
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
dsDNA Doppelstrang-DNA
dsRNA Doppelstrang-RNA
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
for forward
GABA γ-Aminobuttersäure
GCS γ-Glutamylcystein Synthetase
Gln Glutamin
Gly Glycin
GSH Glutathion
His Histidin
Ile Isoleucin
IGF insulin-like growth factor
kb Kilobase
kDa Kilodalton
Km
Michaelis-Konstante
101

L (1-4) C. elegans Larvenstadium (1-4)
LAT L-Typ Aminosäuretransporter
lamp lysosomen-assoziiertes Membranprotein
Leu Leucin
LYAAT lysosomaler Aminosäuretransporter
Met Methionin
mHAT mammalischer heteromerer Aminosäuretransporter
ml Milliliter
MNE mean normalized expression
mM millimolar
SOD Superoxiddismutase
mRNA messenger RNA
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µM mikromolar
NGM nematode growth medium
NMDA N-Methyl-D-Aspartat
NHX Na + /H + -Austauscher
P Signifikanz
PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
PEP Peptidtransporter (in C. elegans)
PEPT Peptidtransporter (im Säugetier)
Phe Phenylalanin
PKC Proteinkinase C
pM pikomolar
rev reverse
RNA Ribonukleinsäure
RNAi RNA interference
RNAse Ribonuklease
ROS reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species)
rpm revolutions per minute
RT Reverse Transkriptase
Ser Serin
Taq Thermus aquaticus
102

Thr Threonin
Tm
Schmelztemperatur
TOR Target of rapamycin
Trp Tryptophan
Tyr Tyrosin
Val Valin
WLB Wurmlyse-Puffer (worm lysis buffer)
103

11 Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Dr. Britta Spanier für die gute Einarbeitung, die vertrauensvolle
Betreuung und die stets hilfreiche Unterstützung im Laufe der Arbeit.
Frau Professor Dr. H. Daniel danke ich für die interessante Themenstellung und die
hervorragenden Arbeitsbedingungen in diesem Institut.
An dieser Stelle möchte ich mich auch bei PD Dr. G. Kottra und Prof. Dr. J. Buchner
herzlichst bedanken, die sie sich als Erst- und Zweitkorrektor zur Verfügung gestellt
haben.
Nicht zuletzt möchte ich mich bei allen bedanken, die durch eine angenehme
Arbeitsatmosphäre und mit steter Hilfsbereitschaft zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen
haben.
104

12 Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Masterarbeit ohne fremde Hilfe und nur unter
Zuhilfenahme der angegebenen Quellen angefertigt habe. Die Arbeit wurde in gleicher
oder ähnlicher Form noch keiner anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Cordula Pertl
München, den 28.06.2005
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