pep-2 - Lehrstuhl für Ernährungsphysiologie - TUM

verwendet man für eine zweite PCR mit dem Primerpaar 1 pep-2_for1 und pep-2_rev1
bzw. Primerpaar 2 pep-2_ko_for und pep-2_ko_rev das Produkt aus der ersten PCR mit
dem Primerpaar 1 pep-2_for1 und pep-2_rev1 als Template.
2.2.11.1 Wurmlyse
In der Wurmlyse wird die genomische DNA aus einem Wurm gewonnen. Zunächst wird
ein Mix aus 50 µl 2x WLB und 2,5 µl Proteinase K hergestellt. Dieser Mix reicht für etwa
15 Würmer. Je ein Wurm wird mit Hilfe einer Pipette in 3 µl Mix aufgenommen und in ein
0,2 µl Eppendorfgefäß überführt. Die Würmer werden anschließend zuerst bei 65°C für 1h
und dann bei 95°C für 10 min inkubiert. Dieses Wurmlysat wird im Anschluss direkt als
Template für die PCRs eingesetzt.
2.2.11.2 Wurm-PCR
Zu 1,5 bis 3 µl Wurmlysat werden direkt 24,5 µl Mastermix, bestehend aus 25 µl Taq-
Puffer (20 mM MgCl2), 25 µl 2 mM dNTP’s, 2 µl 100 pmol/µl pep-2_for1 bzw. pep-
2_ko_for, 2 µl 100 pmol/µl pep-2_rev1 bzw. pep-2_ko_rev und 3 µl Taq-Polymerase pro
10 Proben, pipettiert.
Das PCR-Programm für Primerpaar 1 ist wie folgt:
1. Zyklus: 2 min 93°C
2. – 36. Zyklus: 20 sec 93°C
30 sec 55°C
2 min 30 sec 72°C
∞ 10°C
Das Programm wurde für das Primerpaar 2 pep-2_ko_for und pep-2_ko_rev für spätere
Untersuchungen weiter optimiert, da die Elongationszeit zuvor zu lang gewählt wurde und
viele unspezifische Primeranlagerungen beobachtet wurden.
46