pep-2 - Lehrstuhl für Ernährungsphysiologie - TUM

Random Hexamers (0,5 µg/µl), 0,31 µl RNAse-Inhibitor (40 U/µl), 1µl MMLV Reverse
Transcriptase Rnase H Minus, Point Mutant (200 U/µl) und 8,29 µl PCR-H2O pro Probe.
Nach Zugabe des zweiten Mastermixes werden die Proben für 1 h bei 37°C und 1 min bei
99°C inkubiert. Auch hier ist es wichtig den Mastermix und die Proben zuvor gut zu
mischen. Es ist sinnvoll als Qualitäts-Kontrolle für die vorherige RNA-Extraktion eine
Probe mitzuführen, der kein Enzym zugesetzt wurde (O-Kontroll-Probe). Dadurch lassen
sich eventuelle Verunreinigungen der Proben mit DNA in den späteren LightCycler ®
Amplifikationen nachweisen. Die cDNA wird bis zur Verwendung bei –80°C gelagert.
2.2.8.2 Lightcycler-Amplifikation
Die real-time RT-PCR (reverse transcriptase-polymerase chain reaction) ist eine sehr
empfindliche Technik, um mRNA zu detektieren und zu quantifizieren. Darüber hinaus
stellt die real-time RT-PCR ein wichtiges Werkzeug für die Klonierung, die Erstellung von
cDNA-Bibliotheken, die Synthese von Sonden, Differential Display und für die
Signalverstärkung bei in situ Hybridisierungen dar. Die Technik der real-time RT-PCR
setzt sich aus zwei Stufen zusammen: zunächst muss die cDNA aus der mRNA durch die
Reverse Transkription (RT) gewonnen werden und anschließend kann diese cDNA in einer
spezifischen Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert werden. Die Detektion der
Amplifikationsprodukte erfolgt in Echtzeit, was dieser Technik ihren Namen gab.
Die Polymerasekettenreaktion besteht im wesentlichen aus drei Stufen, die für 30-50
Zyklen wiederholt werden:
1. Denaturierung: Hier wird der Reaktionsansatz auf ca. 95°C erhitzt, um die
Trennung der doppelsträngigen DNA zu bewirken, damit der nächste Schritt
erfolgen kann.
2. Annealing: In diesem Schritt wird die Temperatur wieder erniedrigt (ca.55-60°C,
primerabhängig). Nun lagern sich die einzelsträngigen Primer an die
einzelsträngige DNA an. Primer, die an komplementären Sequenzen gebunden
haben, bleiben dort gebunden, so dass an diesem Stück doppelsträngiger DNA die
DNA-Polymerase ansetzen kann und die DNA komplementär vervollständigen
kann. Dies geschieht im nächsten Schritt.
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