Aus dem Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit des

Aus dem Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit
des Zentrums für Lebensmittelwissenschaften
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
__________________________________________________
Entwicklung von mikroverkapselten
Probiotika-Präparaten
zum Einsatz als Zusatzstoff in Fleischerzeugnissen
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Julia Nina Jähne
aus Bremen
Hannover 2007

Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2007
© 2007 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-939902-35-5
Verlag: DVG Service GmbH
Frankfurter Straße 89
35392 Gießen
0641/24466
geschaeftsstelle@dvg.net
www.dvg.net

Aus dem Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit
des Zentrums für Lebensmittelwissenschaften
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
___________________________________________________________
Entwicklung von mikroverkapselten
Probiotika-Präparaten
zum Einsatz als Zusatzstoff in Fleischerzeugnissen
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Julia Nina Jähne
aus Bremen
Hannover 2007

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. G. Klein
PD Dr. M. Kühne
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. G. Klein
PD Dr. M. Kühne
2. Gutachter: Prof. Dr. G. Breves
Tag der mündlichen Prüfung: 21. Mai 2007
Diese Arbeit wurde gefördert durch die Fritz-Ahrberg-Stiftung, Hannover.

Meiner Familie

Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 15
2 Wissenschaftliches Schrifttum 17
2.1 Probiotika ................................................................................................... 17
2.1.1 Genus Lactobacillus............................................................................ 22
2.1.1.1 L. acidophilus-Gruppe.................................................................. 25
2.1.1.2 L. casei-Gruppe ........................................................................... 27
2.1.1.3 L. reuteri/L. fermentum-Gruppe.................................................... 28
2.1.2 Probiotische Wirkungen ...................................................................... 29
2.1.3 Sicherheit und gesundheitliche Unbedenklichkeit ............................... 35
2.2 Fleischerzeugnisse und Gewürze .............................................................. 42
2.2.1 Begriffsdefinitionen im Zusammenhang mit Fleischerzeugnissen....... 42
2.2.2 Gewürze.............................................................................................. 44
2.2.2.1 Antimikrobielle Wirkung von Gewürzen........................................ 46
2.2.3 Einsatz von Probiotika in Fleischerzeugnissen ................................... 50
2.3 Technologische Verfahren zur Bakterienbearbeitung................................. 55
2.3.1 Fermentation....................................................................................... 55
2.3.2 Lyophilisation ...................................................................................... 57
2.3.3 Mikroverkapselung .............................................................................. 59
2.3.3.1 Aufbau und Materialien ................................................................ 59
2.3.3.2 Verfahren ..................................................................................... 62
2.3.3.3 Freisetzung des Kapselinhaltes ................................................... 67
2.3.3.4 Ziele ............................................................................................. 67
2.4 Zusammenfassende Auswertung des wissenschaftlichen Schrifttums....... 70
3 Eigene Untersuchungen 71
3.1 Material ...................................................................................................... 71
3.1.1 Verwendete Bakterien......................................................................... 71
3.1.1.1 Lyophilisate .................................................................................. 72
3.1.1.2 Mikroverkapselte Bakterien.......................................................... 72

3.1.2 Nährmedien......................................................................................... 74
3.1.2.1 Lösungen ..................................................................................... 76
3.1.3 Lagerungsmaterial .............................................................................. 76
3.1.3.1 Gelatine........................................................................................ 77
3.1.3.2 Zusätze ........................................................................................ 77
3.2 Methoden ................................................................................................... 78
3.2.1 Isolierung, Kultivierung und Sicherung der Stämme ........................... 78
3.2.1.1 L. reuteri (S 24) und L. rhamnosus (S 25).................................... 79
3.2.1.2 L. paracasei (S 26)....................................................................... 80
3.2.1.3 L. gasseri (S 28)........................................................................... 82
3.2.2 Vorversuche........................................................................................ 84
3.2.2.1 Einfluss Gewürze ......................................................................... 85
3.2.2.2 Einfluss Kochsalzkonzentration ................................................... 87
3.2.3 Lyophilisation ...................................................................................... 90
3.2.4 Mikroverkapselung .............................................................................. 90
3.2.5 Einlagerung der Proben und Lagerungsbedingungen......................... 92
3.2.5.1 Befüllung der Probenröhrchen und Lagerungsbedingungen........ 92
3.2.5.2 Probenschlüssel........................................................................... 94
3.2.5.3 Mikrobiologische Untersuchung der Gewürze.............................. 97
3.2.6 Untersuchung der Proben – Lagerungsversuch.................................. 98
3.3 Auswertung .............................................................................................. 100
4 Ergebnisse 103
4.1 Vorversuche ............................................................................................. 103
4.1.1 Vergleich von Spatel- und Tropfplattenverfahren.............................. 104
4.1.2 Einfluss Gewürze und Kochsalzkonzentration .................................. 104
4.1.2.1 Einfluss Gewürze ....................................................................... 105
4.1.2.2 Einfluss Kochsalzkonzentration ................................................. 108
4.1.3 Mikrobiologische Untersuchung der Gewürze................................... 110
4.2 Untersuchung der Proben – Lagerungsversuch....................................... 111
4.2.1 Lagerung der Lyophilisate................................................................. 111
4.2.2 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. reuteri (S 24)................. 113

4.2.2.1 Ohne Zusätze ............................................................................ 113
4.2.2.2 Zusatz NaCl ............................................................................... 114
4.2.2.3 Zusatz Nelken ............................................................................ 116
4.2.2.4 Zusatz Schwarzer Pfeffer........................................................... 116
4.2.3 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. rhamnosus (S 25) ......... 117
4.2.3.1 Ohne Zusätze ............................................................................ 118
4.2.3.2 Zusatz NaCl ............................................................................... 119
4.2.3.3 Zusatz Nelken ............................................................................ 121
4.2.3.4 Zusatz Schwarzer Pfeffer........................................................... 122
4.2.4 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. paracasei (S 26) ........... 123
4.2.4.1 Ohne Zusätze ............................................................................ 124
4.2.4.2 Zusatz NaCl ............................................................................... 125
4.2.4.3 Zusatz Nelken ............................................................................ 126
4.2.4.4 Zusatz Schwarzer Pfeffer........................................................... 126
4.2.5 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. gasseri (S 28) ............... 127
4.2.5.1 Ohne Zusätze ............................................................................ 128
4.2.5.2 Zusatz NaCl ............................................................................... 129
4.2.5.3 Zusatz Nelken ............................................................................ 130
4.2.5.4 Zusatz Schwarzer Pfeffer........................................................... 130
5 Diskussion 133
5.1 Verwendete Bakterien .............................................................................. 133
5.2 Vorversuche ............................................................................................. 135
5.2.1 Vergleich von Spatel- und Tropfplattenverfahren.............................. 135
5.2.2 Einfluss Gewürze .............................................................................. 136
5.2.3 Einfluss Kochsalzkonzentration......................................................... 138
5.3 Lyophilisation ........................................................................................... 138
5.4 Mikroverkapselung ................................................................................... 139
5.5 Lagerungsversuch.................................................................................... 140
5.5.1 Mikrobiologische Untersuchung der Gewürze................................... 140
5.5.2 Einlagerung und Untersuchung der Proben ...................................... 141
5.5.2.1 Lagerung der Lyophilisate.......................................................... 143

5.5.2.2 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. reuteri (S 24) ......... 144
5.5.2.3 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. rhamnosus (S 25).. 146
5.5.2.4 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. paracasei (S 26) .... 147
5.5.2.5 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. gasseri (S 28) ........ 148
5.6 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick ......................................... 149
6 Schlussfolgerungen 153
7 Zusammenfassung 155
8 Summary 157
9 Schrifttumsverzeichnis 159
10 Anhang 189
10.1 Ergebnistabellen....................................................................................... 189
10.2 Nährmedien.............................................................................................. 198
10.2.1 Nährmedien für Laktobazillen............................................................ 198
10.2.2 Weitere Nährmedien für die Untersuchung der Gewürze.................. 200
10.3 Technische Geräte und Verbrauchsmaterialien ....................................... 202
10.4 Abbildungsverzeichnis.............................................................................. 206
10.5 Tabellenverzeichnis.................................................................................. 208

Teilergebnisse dieser Arbeit wurden in einem Posterbeitrag im Rahmen der 47.
Arbeitstagung des Arbeitsgebietes Lebensmittelhygiene der DVG e. V. vorgestellt
(Garmisch-Partenkirchen, 26. bis 29. September 2006).

Abkürzungsverzeichnis
|∆ Kz| Betrag der Differenz der Keimzahlen
∆ Kz Differenz der Keimzahlen
® eingetragenes Warenzeichen
° C Grad Celsius
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
µm Mikrometer
ABAS Ausschuss für Biologische Arbeitsstoffe
Abb. Abbildung
ABl. Amtsblatt
Aqua dest. Aqua destillata
ATCC American Type Culture Collection
B. Bifidobacterium
BAnz. Bundesanzeiger
BArbBl. Bundesarbeitsblatt
BfR Bundesinstitut für Risikobewertung
BG Berufsgenossenschaft
BGBl. Bundesgesetzblatt
BuGBl. Bundesgesundheitsblatt
BVL Bundesamt für Verbraucherschutz und
Lebensmittelsicherheit
C. Candida
comb. nov. combinatio nova
DG SANCO Directorate General for Health and Consumer Protection
DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
Ec. Enterococcus
EFSA The European Food Safety Authority
EG Europäische Gemeinschaft

EU Europäische Union
EWG Europäische Wirtschaftsgemeinschaft
FDA Food and Drug Administration
g Gramm
GMBl. Gemeinsames Ministerialblatt
GRAS Generally Recognized as Safe
h Stunde
KbE Kolonie bildende Einheiten
Kz Keimzahl
l Liter
L. Lactobacillus
L. lateinisch
Lc. Leuconostoc
LFGB Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und
Futtermittelgesetzbuch
lg Logarithmus zur Basis 10/Zehner-/dekadischer Logarithmus
Merr. Merrill
Min. Minute
ml Milliliter
NCDO National Collection of Dairy Organisms
NCFB National Collection of Food Bacteria
NCIMB National Collection of Industrial and Marine Bacteria
P. Pediococcus
pH negativer dekadischer Logarithmus der
Wasserstoffionenkonzentration
PRODEMO Program Demonstration of Nutritional Functionality of
Probiotic Foods
QPS Qualified Presumption of Safety of Micro-organisms in Food
and Feed
RL Richtlinie
S Stamm aus institutseigener Stammsammlung
Sc. Streptococcus

sp. species
sp. nov. species nova
subsp. subspecies
Tab. Tabelle
TRBA Technische Regeln für Biologische Arbeitsstoffe
eingetragenes Warenzeichen
VO Verordnung

1 Einleitung
Einleitung
Probiotika werden immer häufiger zur diätetischen Aufwertung von Lebensmitteln
eingesetzt. Bei den Probiotika handelt es sich um Mono- und Mischkulturen lebender
Mikroorganismen. Die Milchsäurebakterien sind mit weitem Abstand die wichtigsten
Vertreter unter den probiotischen Mikroorganismen. In Lebensmitteln werden v. a.
Stämme der Gattungen Lactobacillus und Bifidobacterium eingesetzt.
Der Einsatz probiotischer Kulturen in Milcherzeugnissen ist weit verbreitet und
technologisch unproblematisch.
Bei der Herstellung von Fleischerzeugnissen werden die Probiotika bisher nur als
Starterkulturen für Rohwürste eingesetzt, wobei technologische Einflüsse während
der Herstellung (z. B. Temperatur, Luftsauerstoff, Zusatzstoffe) die
Überlebensfähigkeit der Probiotika negativ beeinflussen bzw. diese unmöglich
machen.
Ein möglicher Ansatz könnte die Mikroverkapselung der probiotischen
Mikroorganismen sein.
Ziel ist es, die technologischen und mikrobiologischen Grundlagen für den Einsatz
mikroverkapselter Probiotika in Fleischerzeugnissen unterschiedlicher Technologien,
in Fleischzubereitungen und in Convenience-Erzeugnissen zu erarbeiten.
Ausgewählte Laktobazillen mit probiotischer Wirkung werden verschiedenen
Mikroverkapselungsverfahren unterzogen. In einem sich anschließenden
Lagerungsversuch werden die mikroverkapselten Bakterien unterschiedlichen
Lagerungsbedingungen ausgesetzt und der Einfluss verschiedener Zusatzstoffe, wie
Kochsalz und Gewürze, getestet.
In einer Verlaufskontrolle, die sich über den Lagerungszeitraum erstreckt, wird die
Lebensfähigkeit der mikroverkapselten Bakterien überprüft. Auf diese Weise wird
untersucht, ob die mikroverkapselten Laktobazillen für einen Einsatz u. a. in
Gewürzmischungen und essbaren Hüllen in den oben genannten Produkten geeignet
sind.
15

Wissenschaftliches Schrifttum
2 Wissenschaftliches Schrifttum
Das wissenschaftliche Schrifttum gliedert sich im Wesentlichen in drei Abschnitte.
Der erste Teil befasst sich mit den Probiotika im Allgemeinen und speziell mit den
Laktobazillen. Es werden Herkunft, Wirkungen, Taxonomie und physiologische
Eigenschaften, sowie Sicherheit und gesundheitliche Unbedenklichkeit von
Laktobazillen besprochen. Der zweite Teil beschäftigt sich mit Fleischerzeugnissen
und Gewürzen. Ferner wird der Einsatz von probiotischen Bakterien in
Fleischerzeugnissen dargestellt. Der dritte Abschnitt erläutert die verschiedenen
Verfahren zur Bearbeitung von Bakterien mit dem Schwerpunkt der
Mikroverkapselung.
2.1 Probiotika
Probiotika kommen traditionell schon lange in Lebensmitteln, Futtermitteln und
Arzneimitteln (für Mensch und Tier) zum Einsatz. FULLER (1989) bezeichnete mit
dem Begriff Probiotikum ein Futtersupplement in Form lebender Mikroorganismen,
welches die Gesundheit des Wirtstieres günstig beeinflusst, indem es das
Gleichgewicht der Intestinalflora verbessert. Die ARBEITSGRUPPE
„PROBIOTISCHE MIKROORGANISMENKULTUREN IN LEBENSMITTELN“ AM
BUNDESINSTITUT FÜR GESUNDHEITLICHEN VERBRAUCHERSCHUTZ UND
VETERINÄRMEDIZIN (jetzt: BfR) (2000) bestimmte Probiotika als definierte lebende
Mikroorganismen, die in ausreichender Menge in aktiver Form in den Darm gelangen
und hierbei positive gesundheitliche Effekte erzielen. Im Gegensatz dazu, sind
Prebiotika spezifische unverdauliche Stoffe, die selektiv Mikroorganismen in ihrem
Wachstum im Darm fördern und dadurch positive gesundheitliche Wirkungen
erzielen. Synergistisch vereint werden die Vorteile von Pro- und Prebiotika in den
sogenannten Synbiotika, bei denen es sich um eine Kombination aus beiden handelt.
17

18
Wissenschaftliches Schrifttum
In probiotischen Lebensmitteln sind Probiotika in einer Menge enthalten, mit der die
probiotischen Wirkungen nach dem Verzehr eines derartigen Lebensmittels erzielt
werden.
Die empfohlene täglich aufzunehmende, minimale therapeutische Dosis für
probiotische Bakterien liegt bei 10 8 bis 10 9 KbE. Die Empfehlung für das probiotische
Produkt am Ende des Mindesthaltbarkeitsdatums liegt bei 10 6 KbE pro ml (SHAH
2000, KAILASAPATHY u. CHIN 2000). Allerdings können 10 6 KbE/ml unter
Umständen nicht ausreichend sein, wenn man berücksichtigt, dass nicht alle
Bakterien den Darm lebend erreichen. Auf der Basis von In-vitro-Studien erscheint
eine täglich aufzunehmende Dosis probiotischer Bakterien von 10 9 bis 10 10 KbE
notwendig, um probiotische Effekte zu erzielen (SANDERS u. HUIS IN’T VELD
1999).
Nach DE VRESE und SCHREZENMEIER (2000) sind im Produkt
Probiotikakonzentrationen von 10 6 bis 10 9 KbE/g Lebensmittel technisch möglich,
und bis zum Ablauf des Mindesthaltbarkeitsdatums kann eine Keimkonzentration von
≥ 10 6 KbE/g Produkt garantiert werden.
Probiotische Kulturen können sowohl als Bestandteil von Lebensmitteln des
allgemeinen Verzehrs als auch in diätetischen Lebensmitteln in den Verkehr
gebracht werden. In isolierter Angebotsform werden sie dagegen in Deutschland
nicht als Lebensmittel angesehen und sind daher auch keine
Nahrungsergänzungsmittel. Die meisten probiotischen Lebensmittel findet man unter
den Milchprodukten, aber auch zunehmend in Nicht-Milchprodukten, wie z. B.
Getreideprodukten, Süßwaren und Rohwürsten (ARBEITSGRUPPE
„PROBIOTISCHE MIKROORGANISMENKULTUREN IN LEBENSMITTELN“ AM
BUNDESINSTITUT FÜR GESUNDHEITLICHEN VERBRAUCHERSCHUTZ UND
VETERINÄRMEDIZIN (jetzt: BfR) 2000). Probiotische Kulturen werden auch in
Futtermitteln und Arzneimitteln (für Mensch und Tier) (REUTER 2001), z. B. als
lyophilisierte oder suspendierte Kulturen zur oralen Einnahme, eingesetzt.

Wissenschaftliches Schrifttum
Mikroorganismen, die als Probiotika verwendet werden sollen, müssen besondere
funktionelle und physiologische Eigenschaften aufweisen (HOLZAPFEL 2001).
Geeignete Stämme müssen die Magen-Passage lebend passieren und in der Lage
sein, sich im Darm zu vermehren. Diese Eigenschaften sind unter den
Milchsäurebakterien weit verbreitet (REUTER 2001). KALANTZOPOULOS (1997)
wies zusätzlich darauf hin, dass gute probiotische Mikroorganismen lagerungsstabil
sein sollen, bei niedrigen Magen-pH-Werten überleben sollen, in der Lage sein sollen
das Magen-Darmepithel zu besiedeln, nicht pathogen sein dürfen, und imstande sein
sollen einen inhibitorischen Effekt gegenüber dem Wachstum und der
Toxinproduktion von pathogenen Keimen oder Verderbniserregern auszuüben.
SAXELIN (1999) zeigte, dass ausgewählte probiotische Stämme eine Lagerung bei
niedrigen Temperaturen gut überleben können.
Probiotische Lebensmittel sind „Functional Food“ (funktionelle Lebensmittel). Die
Bezeichnung Functional Food wurde als Marketing-Ausdruck Ende der 1980er-Jahre
in Japan geschaffen, um mit gesundheitsfördernden Inhaltsstoffen angereicherte
Lebensmittel zu beschreiben. ERBERSDOBLER (2000) fasst unter Functional Food
Lebensmittel und entsprechend neuentwickelte Produkte zusammen, denen
aufgrund besonderer Inhaltsstoffe mehr als nur der reine Nähr- und Genusswert
zukommt. Im Mittelpunkt stehen die aktive und positive Beeinflussung der
Gesundheit und das Erzielen von spezifischen präventiven Wirkungen durch die
Ernährung.
Probiotische Produkte, v. a. Milchprodukte mit den Spezies Lactobacillus und
Bifidobacterium, machen einen großen Anteil von Functional Food aus (STANTON
2001).
Die Popularität und die Vermarktungserfolge von Probiotika führten dazu, dass
Entwicklungen für probiotische Lebensmittel auch außerhalb des Molkereisektors
vorangetrieben wurden. Voraussetzung ist, dass die probiotischen Stämme sich
unter industriellen Bedingungen produzieren lassen, und anschließend als gefrorene
oder gefriergetrocknete Kulturen überleben und ihre Funktionalität wieder erlangen.
19

20
Wissenschaftliches Schrifttum
Dasselbe gilt für die probiotischen Lebensmittel, in die die Stämme dann letztendlich
verbracht werden. Wichtig ist auch, dass die Probiotika in dem jeweiligen
Lebensmittel keine negativen Geruchs-, Geschmacks- oder Textureindrücke
bewirken (MATTILA-SANDHOLM et al. 2002).
Milchsäurebakterien sind die wichtigsten Vertreter der probiotischen
Mikroorganismen. Daneben werden aber auch Nicht-Milchsäurebakterien als
Probiotika eingesetzt, wie z. B. Bacillus (KLEIN 2001).
Nach AXELSSON (2004) gehören zu den hauptsächlich in der
Lebensmitteltechnologie eingesetzten Milchsäurebakterien die Gattungen
Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,
Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus,
Vagococcus und Weissella, wobei insgesamt zu den Milchsäurebakterien mehr als
zwanzig Gattungen zählen. Die Gattung Bifidobacterium wird nach AXELSSON
(2004) häufig auch zu den echten Milchsäurebakterien gezählt, ist aber streng
genommen mit diesen phylogenetisch nicht verwandt, auch wenn einige
Charakteristika übereinstimmen.
Stämme, die in Europa als Probiotika Verwendung finden, gehören überwiegend den
Genera Lactobacillus, Enterococcus und Bifidobacterium an (KLEIN 2001). Die
nachfolgende Tabelle 1 gibt eine Übersicht über wichtige technologisch genutzte
Genera und probiotisch eingesetzte Spezies der Milchsäurebakterien.

Wissenschaftliches Schrifttum
Tabelle 1: Wichtige technologisch genutzte Genera und probiotisch
eingesetzte Spezies der Milchsäurebakterien (KLEIN 2001)
Genus Spezies
Lactobacillus L. acidophilus-Gruppe
(L. acidophilus, L. crispatus,
L. gasseri, L. johnsonii)
L. casei-Gruppe
(L. casei, L. paracasei,
L. rhamnosus)
Anwendung 1
P S M F TE H
● ● ● ● ●
● ● ● ● ●
L. reuteri/L. fermentum ● ● ● ● ● ●
L. sakei/L. curvatus ●
Bifidobacterium B. longum, B. animalis, B. infantis,
B. breve
● ● ● ● ●
Enterococcus Ec. faecium, Ec. faecalis ● ● ● ● ●
Lactococcus L. lactis subsp. lactis ● ●
Pediococcus P. acidilactici, P. damnosus,
P. pentosaceus
● ●
Leuconostoc Lc. mesenteroides, Lc. lactis ● ●
Streptococcus Sc. salivarius subsp. thermophilus ● ●
Carnobacterium C. piscicola ● ●
1 hauptsächlicher Anwendungsbereich,
P Probiotikum
S Starterkultur
M Milchtechnologie
F Fleischtechnologie
TE Tierernährung
H Humanmedizin
Milchsäurebakterien sind grampositive Kokken oder Stäbchen, die keine Sporen
ausbilden und die aus Kohlenhydraten Milchsäure fermentieren. Die Einteilung der
Milchsäurebakterien in die verschiedenen Genera erfolgt aufgrund der Morphologie,
der Art der Glukosefermentation, des Wachstums bei verschiedenen Temperaturen,
21

22
Wissenschaftliches Schrifttum
der Konfiguration der produzierten Milchsäure, der Fähigkeit bei hohen
Salzkonzentrationen zu wachsen und der Toleranz bezüglich des pH-Wertes.
Chemotaxonomische Marker wie die Zusammensetzung der Fettsäuren sowie die
Bestandteile der Zellwände wurden ebenfalls zur Klassifikation herangezogen.
Zusätzlich werden in der gegenwärtigen Taxonomie phylogenetische Beziehungen
mit berücksichtigt. In den meisten Fällen bilden die Gattungen eigene
phylogenetische Gruppen. Es gibt jedoch auch Ausnahmen, bei denen die
phylogenetischen Muster nicht mit den gegenwärtigen Klassifizierungen aufgrund der
phänotypischen Eigenschaften übereinstimmen. Dies ist zum Beispiel der Fall für die
Gattungen Lactobacillus und Pediococcus (AXELSSON 2004).
2.1.1 Genus Lactobacillus
Laktobazillen kommen in vielen verschiedenen Bereichen der Umwelt vor. Sie sind
physiologische Bewohner der Mundhöhle, des Intestinaltraktes und der Vagina des
Menschen. Außerdem kommen Laktobazillen auch in Pflanzen und Pflanzenmaterial
vor. Ebenso sind sie Bestandteil von Erdboden, Wasser, Silage, Abwasser und
Gülle. Ein großes Einsatzgebiet für Laktobazillen ist die Lebensmittelherstellung
(z. B. Fermentationen). Hier werden Laktobazillen z. B. bei der Herstellung von
Milcherzeugnissen, aber auch als Starterkulturen bei der Rohwurstherstellung
verwendet. Ein weiteres wichtiges Einsatzgebiet sind die Probiotika. Andererseits
können Laktobazillen aber auch für den Verderb von Lebensmitteln, wie z. B. Milch
und Milcherzeugnissen, Fleisch und Fleischerzeugnissen, Fischmarinaden oder Bier,
verantwortlich sein (STILES u. HOLZAPFEL 1997).
Die Gattung Lactobacillus umfasst derzeit 135 anerkannte Spezies und 27
Subspezies (EUZÉBY 2006). Vertreter der Gattung Lactobacillus sind grampositive,
kurze bis lange, z. T. auch kokkoide Stäbchen. Einige Stämme und Spezies bilden in
Abhängigkeit vom pH-Wert und der Zusammensetzung des Mediums Ketten.
Kokkoide Formen kommen unter den obligat heterofermentativen Laktobazillen und

Wissenschaftliches Schrifttum
bei L. sakei vor. Laktobazillen sind mikroaerophil oder anaerob. Das
Oberflächenwachstum wird bei reduzierter Sauerstoffspannung und einem CO2-
Gehalt von 5 - 10 % gefördert. Einige Stämme bilden bipolare Körper und Granula,
die bei der Gram- und Methylenblaufärbung erkennbar sind. Der Stoffwechsel der
Laktobazillen ist fermentativ. Sie sind obligat saccharolytisch und meist Katalase-
negativ. Laktobazillen können sich bei Temperaturen zwischen 2 °C und 55 °C
vermehren, wobei das Optimum je nach Gruppe bei 30 °C bis 40 °C liegt. Der
optimale pH-Wert-Bereich für das Wachstum liegt bei 5,5 bis 6,2 (BAUMGART u.
BECKER 2003). Laktobazillen bilden keine Sporen und sind nicht beweglich
(HAMMES u. VOGEL 1995).
Die Einteilung in verschiedene Spezies erfolgt sowohl nach klassischen
phänotypischen Eigenschaften, als auch mit weitergehenden molekularbiologischen
Methoden. Eine Kombination der Methoden ist sinnvoll. Die klassische Einteilung der
Gattung Lactobacillus in die drei Subgenera „Thermobacterium“, „Betabacterium“
und „Streptobacterium“ geht zurück auf ORLA-JENSEN (1919) und wurde auch von
KANDLER und WEISS (1986) beschrieben. Grundlage für diese Einteilung waren die
biochemischen und physiologischen Eigenschaften, vor allem Fermentationswege
und Wachstumstemperaturen. Es wird zwischen einem homofermentativen und
einem heterofermentativen Fermentationsweg unterschieden. Bei der
homofermentativen Fermentation entsteht beim Abbau von Glukose kein Gas. Im
Gegensatz dazu kommt es beim heterofermentativen Fermentationsweg zur
Gasbildung bei der Verwertung von Glukose. SCHLEIFER und LUDWIG (1995)
konnten durch den Einsatz neuerer phylogenetischer und molekularbiologischer
Methoden zeigen, dass es Überschneidungen zwischen den genannten Subgenera
gibt. Die aktuelle Einteilung unterscheidet zwischen fakultativ und obligat
heterofermentativen Organismen (Tab. 2).
23

24
Wissenschaftliches Schrifttum
Tabelle 2: Einteilung des Genus Lactobacillus in Subgenera (nicht mehr
gültig) bzw. in phänotypische/molekularbiologische Untergruppen
(KLEIN 2001)
Einteilung Fermentationsweg Wachstums-
Subgenera 1
temperatur
„Thermobacterium“ homofermentativ 2 15 °C neg.,
45 °C pos.
„Streptobacterium“ homofermentativ 2 15 °C pos.,
45 °C neg.
Typische
biotechnologisch
genutzte Vertreter
L. acidophilus-Gruppe
L. casei-Gruppe 4 ,
L. sakei/L. curvatus
„Betabacterium“ heterofermentativ 2 uneinheitlich L. reuteri/L. fermentum
phänotypisch/molekularbiologische Untergruppe 3
Gruppe A obligat
homofermentativ,
Pentosen werden
nicht fermentiert
Gruppe B fakultativ
heterofermentativ
(Gas von Pentosen)
Gruppe C obligat
heterofermentativ
(Gas aus Glukose
und Pentosen)
entfällt L. acidophilus-Gruppe
entfällt L. casei-Gruppe,
L. sakei/L. curvatus
entfällt L. reuteri/L. fermentum
1
nach KANDLER und WEISS (1986)
2
bei Verwertung von Glukose (homofermentativ: keine Gasbildung; heterofermentativ: Gasbildung)
3
zusammengefasst von HAMMES und VOGEL (1995)
4
Vertreter der L. casei-Gruppen sind in der Lage, bei 45 °C zu wachsen
Obligat homofermentative Laktobazillen fermentieren Hexosen zu Milchsäure,
Pentosen werden hingegen nicht fermentiert. Fakultativ heterofermentative
Laktobazillen fermentieren Hexosen entweder zu Milchsäure oder zu Milchsäure,

Wissenschaftliches Schrifttum
Essigsäure, Ethanol und Ameisensäure. Pentosen werden zu Milchsäure und
Essigsäure fermentiert, und aus Glucose wird kein CO2 gebildet. Obligat
heterofermentative Laktobazillen fermentieren Hexosen zu Milchsäure, Essigsäure,
Ethanol und CO2, Pentosen hingegen zu Milchsäure und Essigsäure (BAUMGART u.
BECKER 2003).
Ebenso wie die Fermentation sind auch weitere Eigenschaften der Laktobazillen
abhängig von der Spezies. Dazu gehören zum Beispiel das Wachstumsverhalten
unterhalb von 10 °C und oberhalb von 45 °C, sowie das Wachstum in Gegenwart von
6,5 % NaCl und bei pH 4,4. Für alle Lactobacillus-Spezies gilt hingegen, dass bei
18 % NaCl bzw. einem pH-Wert größer als 9,6 kein Wachstum mehr stattfindet.
Speziesabhängig ist auch, ob D- oder L-Milchsäure, bzw. beide produziert werden
(AXELSSON 2004).
Typische Vertreter der drei aufgrund des Fermentationsverhaltens eingeteilten
Gruppen A (L. acidophilus-Gruppe), B (L. casei-Gruppe) und C
(L. reuteri/L. fermentum-Gruppe) (siehe Tab. 2) sollen im Folgenden näher
besprochen werden.
2.1.1.1 L. acidophilus-Gruppe
JOHNSON et al. (1980) führten umfassende Studien zur Taxonomie der
L. acidophilus-Gruppe durch. Untersucht wurden u. a. die physiologischen
Eigenschaften, die Art der Milchsäureproduktion, die Zuckerzusammensetzung der
Zellwände und die DNA-Strukturen. Aufgrund der Ergebnisse kam es zur
taxonomischen Neuordnung der L. acidophilus-Gruppe. Neben L. acidophilus
gehören fünf weitere Spezies zur L. acidophilus-Gruppe: L. crispatus, L. amylovorus,
L. gallinarum, L. gasseri und L. johnsonii. Vertreter der L. acidophilus-Gruppe
fermentieren obligat homofermentativ.
Die Tabelle 3 gibt einen Überblick über Referenzen zu der jeweiligen Spezies, sowie
über die nach EUZÉBY (2006) u. a. verwendeten Stammbezeichnungen für die
25

26
Wissenschaftliches Schrifttum
Typstämme durch die ATCC und die DSM. In Probiotika kommen aus der
L. acidophilus-Gruppe lediglich L. gasseri, L. johnsonii und zum Teil auch
L. acidophilus und L. crispatus zum Einsatz (KLEIN 1998).
Tabelle 3: L. acidophilus-Gruppe, Referenzen und Typstämme
Spezies Referenzen Typstämme
L. acidophilus MORO (1900);
HANSEN u. MOCQUOT (1970);
JOHNSON et al. (1980)
ATCC 4356 T , DSM 20079 T
L. crispatus BRYGOO u. ALADAME (1953);
CATO et al. (1983)
ATCC 33820 T , DSM 20584 T
L. amylovorus NAKAMURA (1981) ATCC 33620 T , DSM 20531 T
L. gallinarum FUJISAWA et al. (1992) ATCC 33199 T , DSM 10532 T
L. gasseri LAUER u. KANDLER (1980) ATCC 33323 T , DSM 20243 T
L. johnsonii FUJISAWA et al. (1992) ATCC 33200 T , DSM 10533 T
L. = Lactobacillus
ATCC = American Type Culture Collection
DSM = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
T
= Typstamm
Ein wichtiger Vertreter der L. acidophilus-Gruppe ist L. gasseri. L. gasseri wurde
benannt nach F. Gasser, der bahnbrechende Studien über die Laktat-
Dehydrogenasen von Lactobacillus-Spezies durchführte. L. gasseri stellt sich
mikroskopisch als Stäbchen mit abgerundeten Enden dar, mit einer Größe von
0,6 - 0,8 µm x 3,0 - 5,0 µm und kommt einzeln oder in Ketten vor. Makroskopisch
sind die Kolonien rau und flach. Das Wachstum wird unter anaeroben Bedingungen
und bei 5 % CO2 gefördert. Stämme wurden aus der Mundhöhle, dem Darm, Kot und
der Vagina des Menschen isoliert (LAUER u. KANDLER 1980; HAMMES u. VOGEL
1995).

2.1.1.2 L. casei-Gruppe
Wissenschaftliches Schrifttum
Die L. casei-Gruppe, deren Vertreter fakultativ heterofermentativ sind, umfasst vier
Spezies: L. casei, L. paracasei, L. rhamnosus und L. zeae. Die drei erst genannten
Spezies werden als Probiotika eingesetzt (KLEIN et al.1998). Historisch bestand die
L. casei-Gruppe zunächst nur aus einer Spezies mit fünf Subspezies. COLLINS et al.
(1989) schlugen die Reklassifizierung vor. Die Tabelle 4 stellt Referenzen, sowie
Typstämme der Spezies dar (EUZÉBY 2006).
Tabelle 4: L. casei-Gruppe, Referenzen und Typstämme
Spezies Referenzen Typstämme
L. casei ORLA-JENSEN (1916); ATCC 393
HANSEN u. LESSEL (1971)
T , DSM 20011 T ,
NCIMB 11970 T (= NCDO 161 T )
L. paracasei COLLINS et al. (1989) ATCC 25302 T , DSM 5622 T ,
NCIMB 700151 T (= NCDO 151 T )
L. rhamnosus HANSEN (1968);
ATCC 7469
COLLINS et al. (1989)
T , DSM 20021 T ,
NCIMB 6375 T (= NCDO 243 T )
L. zeae DICKS et al. (1996) ATCC 15820 T , DSM 20178 T ,
NCIMB 9537 T
L. = Lactobacillus
ATCC = American Type Culture Collection
DSM = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
NCIMB = National Collection of Industrial and Marine Bacteria
NCDO = National Collection of Dairy Organisms
T
= Typstamm
Zwei technologisch bedeutsame Vertreter der L. casei-Gruppe sind L. paracasei und
L. rhamnosus (HAMMES u. VOGEL 1995).
L. paracasei trägt den Namen aufgrund der Ähnlichkeit zu L. casei. Mikroskopisch
erscheint L. paracasei stäbchenförmig, 0,8 - 1,0 µm x 2,0 - 4,0 µm groß, häufig mit
breiten Enden, einzeln oder in Ketten, nicht beweglich.
27

28
Wissenschaftliches Schrifttum
L. paracasei wächst bei 10 °C bis 40 °C, einige Stämme auch zwischen 5 °C und
45 °C. Es gibt zwei anerkannte Subspezies: L. paracasei subsp. paracasei
(ATCC 25302 T , DSM 5622 T , NCIMB 700151 T bzw. früher NCDO 151 T ) und
L. paracasei subsp. tolerans (ATCC 25599 T , DSM 20258 T , NCIMB 9709 T bzw.
früher NCFB 2774 T ).
Stämme von L. paracasei subsp. paracasei wachsen bei 10 °C bis 40 °C, einige
auch bei 5 °C bis 45 °C. Isoliert wurden die Stämme aus Molkereiprodukten (z. B.
Käse, pasteurisierte Milch), Abwasser, Silage, sowie aus Mundhöhle, Speichel und
Karies von Menschen.
Die Bezeichnung L. paracasei subsp. tolerans steht dafür, dass diese Subspezies
sehr tolerant gegenüber bestimmten Umgebungsbedingungen ist, d. h. es wird z. B.
die Pasteurisierung der Milch überstanden. Wachstum findet zwischen 10 °C und
37 °C statt, nicht mehr bei 40 °C. Hingegen wird ein Erhitzen auf 72 °C für 40 s von
diesen Keimen überlebt. Isoliert wurden die Stämme aus Molkereiprodukten (z. B.
Käse, Sauermilch), aber auch aus menschlichem Blut und Lungenabzessen
(COLLINS et al. 1989; HAMMES u. VOGEL 1995)
L. rhamnosus bezieht sich auf die Rhamnose, ein 6-Desoxy-Monosaccharid.
Mikroskopisch ist L. rhamnosus ebenfalls stäbchenförmig, 0,8 - 1,0 µm x 2,0 - 4,0 µm
groß, häufig mit breiten Enden, einzeln oder in Ketten, nicht beweglich. Wachstum
erfolgt zwischen 15 °C und 45 °C, die meisten Stämme wachsen auch noch bei
10 °C und einige Stämme ebenfalls bei 48 °C. Die Stämme wurden aus
Molkereiprodukten, Abwasser, menschlichem Speichel, sowie bei klinischen Fällen
aus Lymphknoten und Endocard isoliert (HANSEN 1968; COLLINS et al. 1989;
HAMMES u. VOGEL 1995).
2.1.1.3 L. reuteri/L. fermentum-Gruppe
Zu der Untergruppe obligat heterofermentativer Laktobazillen gehören die Spezies
L. reuteri und L. fermentum (KLEIN et al. 1998). Der Tabelle 5 können Referenzen

Wissenschaftliches Schrifttum
und Typstämme zu den Spezies dieser Gruppe entnommen werden. Nach KLEIN
(2001) werden beide Spezies auch als Probiotika eingesetzt.
Tabelle 5: L. reuteri/L. fermentum-Gruppe, Referenzen und Typstämme
Spezies Referenzen Typstämme
L. reuteri KANDLER et al. (1980) ATCC 23272 T , DSM 20016 T
L. fermentum BEIJERINCK (1901);
DELLAGLIO (2004)
ATCC 14931 T , DSM 20052 T
L. = Lactobacillus
ATCC = American Type Culture Collection
DSM = Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
T
= Typstamm
Lactobacillus reuteri, als ein Vertreter dieser Gruppe, wurde nach dem deutschen
Bakteriologen G. Reuter benannt. Mikroskopisch stellt sich L. reuteri ein wenig
irregulär als gekrümmtes Stäbchen, 0,7 - 1,0 µm x 2,0 - 5,0 µm groß, mit
abgerundeten Enden, einzeln, in Paaren oder kleinen Gruppen, dar. Die Stämme
wurden aus menschlichem und tierischem Kot, aus Fleischprodukten und Sauerteig
isoliert (KANDLER et al. 1980; HAMMES u. VOGEL 1995).
2.1.2 Probiotische Wirkungen
Gesundheitswirkungen müssen durch randomisierte, doppelblinde und
placebokontrollierte klinische Studien und mit klar definierten Studienzielen an
Menschen belegt werden. Ergebnisse sollten von unabhängigen Forschergruppen
bestätigt und in kritischen wissenschaftlichen Zeitschriften publiziert oder nach GCP-
Vorschrift („good clinical practice“) dokumentiert sein. In-vitro- und tierexperimentelle
Untersuchungen liefern lediglich Hinweise auf mögliche gesundheitsrelevante
Wirkungen, können evtl. Wirkmechanismen entschlüsseln oder bei der Suche nach
neuen Probiotika helfen. Beweise für gesundheitliche Effekte gelten nur für genau die
29

30
Wissenschaftliches Schrifttum
probiotischen Lebensmittel, die Probiotika, die Keimkonzentrationen und die
Verzehrsmenge und -dauer, mit denen die jeweiligen Studien durchgeführt worden
sind. Auch nah verwandte Bakterienstämme der gleichen Spezies können
unterschiedliche physiologische Wirkungen haben, die also stammspezifisch sind.
Allerdings sind Studienergebnisse auf ähnliche Lebensmittel übertragbar, bei denen
nach dem Stand des Wissens keine unterschiedlichen Matrixeffekte zu erwarten
sind. Wichtig für eindeutige Studienergebnisse ist, dass die verwendeten
Bakterienstämme gut charakterisiert und eindeutig identifiziert sind. Erforderlich sind
nicht nur Untersuchungen zu Dosis-Wirkungsbeziehungen, sondern auch
Langzeitstudien zur Dauer der Wirkung (DE VRESE u. SCHREZENMEIR 2000).
Aufgrund der Tatsache, dass jeder Mensch eine individuelle, äußerst komplexe
Darmflora besitzt, die taxonomisch nicht ausreichend charakterisiert ist, ergeben sich
durchaus Schwierigkeiten beim Nachweis von Gesundheitseffekten. Für den
einzelnen Verbraucher lässt sich eine Gesundheitswirkung von Probiotika also nicht
individuell vorhersagen (TEUBER 1998).
Die Tabelle 6 gibt eine Übersicht über die nach DE VRESE und SCHREZENMEIR
(2000) gesicherten und möglichen Gesundheitseffekte von Pro- und Prebiotika.

Wissenschaftliches Schrifttum
Tabelle 6: Gesicherte und mögliche Gesundheitseffekte von Pro- und
Prebiotika (DE VRESE u. SCHREZENMEIR 2000)
Gesicherte Effekte Mögliche Effekte
• Geringere Häufigkeit und Dauer • Förderung oder Erhalt einer
verschiedener
optimalen Darmflora,
Durchfallerkrankungen
Motilitätsregulierung bei Obstipation
• Einsetzbar bei Vaginitis
• Senkung der Konzentration
gesundheitsschädlicher
Stoffwechselprodukte und
krebspromovierender Enzyme im
Dickdarm
• Verhinderung von Krebs
• Immunmodulation • Stärkung des Immunsystems,
Verhinderung von
Infektionskrankheiten, Reduktion von
Allergien und
Autoimmunerkrankungen,
Einsatzmöglichkeiten als Adjuvans
• Senkung des Cholesterolspiegels,
Beeinflussung des
Lipidstoffwechsels
• Förderung der Laktoseverdauung bei • Steigerung der
Laktosemalabsorbern
Mineralstoffresorption,
Osteoporoseprävention
Die in klinischen Studien als probiotisch wirksam eingestuften Bakterien gehören
hauptsächlich zu den Gattungen Lactobacillus und Bifidobacterium, welche auch
natürlicherweise im menschlichen Intestinaltrakt gefunden werden (VAUGHAN
1999).
31

32
Wissenschaftliches Schrifttum
Das Konzept, die Darmflora zu stabilisieren und positive gesundheitliche Wirkungen
von Milchsäurebakterien auszunutzen, besteht bereits seit langer Zeit (HAWLEY et
al. 1959, SANDERS 1993; STEER et al. 2000; KOPP-HOOLIHAN 2001;
MCNAUGHT u. MACFIE 2001). Die Darmflora kann durch die Zufuhr von lebenden
Mikroorganismen zumindest kurzfristig modifiziert werden (DEUTSCHE
GESELLSCHAFT FÜR ERNÄHRUNG 2004). Klinische Studien belegen, dass
zahlreiche Mikroorganismen die Fähigkeit besitzen, Schwere und Dauer bestimmter
Durchfallerkrankungen günstig zu beeinflussen (MARTEAU et al. 2001).
In einer doppelblinden, placebokontrollierten, randomisierten, klinischen Studie
konnten KOEBNICK et al. (2001) nachweisen, dass die regelmäßige Aufnahme
eines fermentierten Getränks (Yakult ® ) mit dem Stamm Lactobacillus casei Shirota
(LcS) bei obstipierten und ansonsten gesunden Personen gastrointestinale
Parameter, insbesondere die Stuhlabsatzfrequenz und -konsistenz, verbesserte.
Eine Verbesserung gastrointestinaler Symptome nach Zufuhr von LcS weist auf
Veränderungen der Darmflora und des intestinalen Milieus hin. Zusätzlich wurde
auch das allgemeine Wohlbefinden gesteigert.
Nach KRAMMER et al. (2005) und SPILLER und CAMPBELL (2006) gehören
Probiotika nach ersten Studienergebnissen zu den neuen hoffnungsvollen
Therapieansätzen bei postinfektiösem Reizdarm. Außerdem zeigen einige
probiotische Stämme Erfolg bei der Unterstützung der medikamentösen Therapie
von Colitis ulcerosa und Pouchitis.
Zu den Wirkungen von Probiotika bei der Therapie von Morbus Crohn liegen
widersprüchliche Beobachtungen vor (GIONCHETTI 2005).
Erste Ergebnisse von ISHIKAWA (2005) sprechen dafür, dass dem Wiederauftreten
von colorectalen Tumoren durch Probiotika vorgebeugt werden kann.
Mehrere Studien belegen, dass Probiotika geeignet sind, Antibiotika assoziierte
Diarrhoen zu verhindern oder zumindest zu verkürzen. Ebenfalls können probiotische
Stämme bei Säuglingen und Kleinkindern mit Rotavirus-Enteritiden die
Durchfalldauer verkürzen (MARTEAU et al. 2001).

Wissenschaftliches Schrifttum
Es gibt zahlreiche Beweise dafür, dass Milchsäurebakterien bei
Laktosemalabsorbern Durchfälle und andere Intoleranzsymptome nach
Laktoseverzehr verhindern, indem sie die Laktoseverdauung fördern, wobei es sich
jedoch nicht um eine spezifisch probiotische Wirkung handelt. Probiotische Bakterien
haben zum Teil eine niedrigere ß-Galaktosidaseaktivität und fördern die
Laktoseverdauung weniger als andere Joghurtkulturen (SUHR et al. 1995).
Weiterhin konnte in mehreren Studien gezeigt werden, dass bestimmte probiotische
Stämme, wenn diese in ausreichender Menge verzehrt werden, in der Lage sind, die
angeborene und erworbene Immunantwort zu beeinflussen. Überexprimierte
Immunantworten werden reguliert und andere gefördert (GILL u. GUARNER 2004).
Die Modulation einzelner immunologischer Parameter ist nicht automatisch mit einer
Stärkung der Immunabwehr gleichzusetzen. Vielmehr müssen Wirkmechanismen
untersucht, sowie positive Gesundheitseffekte durch kontrollierte klinische Studien
nachgewiesen werden, d. h. eine Verhinderung, Verkürzung oder Linderung von
Infektionskrankheiten oder positive Wirkungen bei Immunstörungen. Die Tabelle 7
fasst die immunmodulatorischen Effekte von Probiotika zusammen (DE VRESE u.
SCHREZENMEIR 2000).
33

34
Wissenschaftliches Schrifttum
Tabelle 7: Immunmodulatorische Effekte von Probiotika (DE VRESE u.
SCHREZENMEIR 2000)
Beeinflussung von Parametern der spezifischen und unspezifischen
Immunabwehr:
• Anregung der Zellteilung in Organen des Lymphsystems
• Steigerung der Aktivität von Phagozyten/Makrophagen, Lymphozyten, natürl.
Killerzellen
• Anregung der Produktion unspezifischer und spezifischer Antikörper
• Freisetzung von nicht pro-inflammatorischen Zytokinen, Interleukinen,
Interferonen, TNF-α
Beeinflussung von Immunantworten auf verschiedene Antigene:
• Anregung der Produktion spez. Antikörper (IgA, IgG) gegen mitverabreichte
Viren, Bakterien und Bakterientoxine
• Erhöhte Widerstandskraft und – im Tierversuch – längeres Überleben bei viralen
und bakteriellen Infektionen
• Möglicher Einsatz als Adjuvans bei Impfungen
• Förderung der Entwicklung von oraler Toleranz; Abschwächung allergischer
Reaktionen
Wirkungen bei verschiedenen Erkrankungen:
• Weniger Dickdarmentzündungen und gesteigerte Immunität bei Älteren
• Geringere Anfälligkeit gegen Candida-Infektionen bei chemotherapierten
Leukämiekranken
• Weniger und spätere Rückfälle bei operativ entferntem Gallenblasenkrebs
• Bei Atopikern keine Verschlechterung immunologischer Reaktionen durch
Joghurtverzehr
• Weniger klinische Symptome und erniedrigtes TNF-α bei Kindern mit atopischer
Dermatitis
• Weniger klinische Symptome bei nasaler Allergie

Wissenschaftliches Schrifttum
Nach SIEBER und DIETZ (1998) gibt es Hinweise dafür, dass Laktobazillen bei
lokalem und oralem Einsatz durch Stabilisierung des Biofilms, Hemmung der
Anheftung und Invasion von Pathogenen und Erleichterung des Eindringens von
Antibiotika zu einer Verbesserung von Prophylaxe und Therapie urogenitaler Infekte
(z. B. Vaginitis) beitragen.
2.1.3 Sicherheit und gesundheitliche Unbedenklichkeit
Die Biostoffverordnung (ANONYM 1999) regelt gemeinsam mit den Technischen
Regeln für Biologische Arbeitsstoffe (TRBA) (ANONYM 2006) den Umgang mit
Mikroorganismen. Die Biostoffverordnung wurde aufgrund der Umsetzung der EG-
Richtlinie 90/679/EWG (ANONYM 1990) erlassen, die inzwischen von der Richtlinie
2000/54/EG (ANONYM 2000) abgelöst wurde. In dieser Richtlinie wird das Genus
Lactobacillus generell in die Risikogruppe 1 eingestuft und es erfolgt keine
weitergehende Unterscheidung. Nach § 3 der Biostoffverordnung werden vier
Risikogruppen für biologische Arbeitsstoffe unterschieden (Tab. 8).
Tabelle 8: Risikogruppen für biologische Arbeitsstoffe nach § 3
Biostoffverordnung (ANONYM 1999)
Risikogruppe Beschreibung
1 – kein Risiko Biologische Arbeitsstoffe, bei denen es unwahrscheinlich
ist, dass sie beim Menschen eine Krankheit verursachen.
2 – geringes Risiko Biologische Arbeitsstoffe, die eine Krankheit beim
Menschen hervorrufen können und eine Gefahr für
Beschäftigte darstellen können; eine Verbreitung des
Stoffes in der Bevölkerung ist unwahrscheinlich; eine
wirksame Vorbeugung oder Behandlung ist normalerweise
möglich.
35

36
Wissenschaftliches Schrifttum
Risikogruppe Beschreibung
3 – mäßiges Risiko Biologische Arbeitsstoffe, die eine schwere Krankheit beim
Menschen hervorrufen können und eine ernste Gefahr für
Beschäftigte darstellen können; die Gefahr einer
Verbreitung in der Bevölkerung kann bestehen, doch ist
normalerweise eine wirksame Vorbeugung oder
4 – hohes Risiko
Behandlung möglich.
Biologische Arbeitsstoffe, die eine schwere Krankheit beim
Menschen hervorrufen und eine ernste Gefahr für
Beschäftigte darstellen; die Gefahr einer Verbreitung in der
Bevölkerung ist unter Umständen groß; normalerweise ist
eine Vorbeugung oder Behandlung nicht möglich.
Der Ausschuss für Biologische Arbeitsstoffe (ABAS) stellt die Technischen Regeln
für Biologische Arbeitstoffe (TRBA), die den Stand der sicherheitstechnischen,
arbeitsmedizinischen, hygienischen sowie arbeitswissenschaftlichen Anforderungen
bei Tätigkeiten mit biologischen Arbeitstoffen wiedergeben, auf. Der Fachausschuss
Chemie hat die BG-Information BGI 633 „Sichere Biotechnologie – Einstufung
biologischer Arbeitsstoffe: Prokaryonten (Bacteria und Archaea)“ erarbeitet. Der
ABAS hat in Anwendung des Kooperationsmodells (BArbBl. 5/2001, S. 61) die
Einstufungsliste der Bakterien und Archaebakterien aus dieser BG-Information in
sein technisches Regelwerk als TRBA 466 (ANONYM 2006) übernommen. Darin
enthalten ist eine Liste der Einstufung von Bakterien und Archaebakterien. Die
meisten Vertreter des Genus Lactobacillus werden in die Risikogruppe 1
eingeordnet, wobei einige von ihnen mit einem Zusatz versehen sind, dass sie in
Einzelfällen, überwiegend bei erheblich abwehrgeminderten Menschen, als
Krankheitserreger nachgewiesen oder vermutet wurden. Einige wenige Spezies des
Genus Lactobacillus werden hingegen auch in die Risikogruppe 2 eingeordnet. Von
diesen Vertretern der Risikogruppe 2 wiederum sind einige mit dem Zusatz
versehen, dass z. T. Stämme langjährig sicher in der technischen Anwendung
gehandhabt wurden, und daher als bewährte Stämme in die Risikogruppe 1 fallen

Wissenschaftliches Schrifttum
können. Die nachfolgende Tabelle 9 zeigt die Zuordnung einiger Lactobacillus-
Spezies zu Risikogruppen nach TRBA 466 (ANONYM 2006).
Tabelle 9: Risikogruppen der in Tab. 3 - 5 genannten Laktobazillen nach
TRBA 466 (ANONYM 2006)
Spezies Risikogruppe nach TRBA 466 (2006)
L. acidophilus 1+
L. amylovorus 1
L. casei 1
L. crispatus 1+
L. fermentum 1
L. gallinarum 1
L. gasseri 1+
L. johnsonii 1+
L. paracasei 1
L. reuteri 1
L. rhamnosus 2TA
L. zeae 1
TRBA Technische Regeln für Biologische Arbeitsstoffe
1 kein Risiko
2 geringes Risiko
+ in Einzelfällen als Krankheitserreger nachgewiesen oder vermutet, überwiegend bei erheblich
abwehrgeminderten Menschen; Identifizierung der Art oft nicht zuverlässig
TA Arten, von denen Stämme bekannt sind, die langjährig sicher in der technischen Anwendung
gehandhabt wurden; diese bewährten Stämme können daher nach den Einstufungskriterien in
die Risikogruppe 1 fallen
Zu berücksichtigen ist, dass sich die Eingruppierung in Risikogruppen auf
Sicherungsmaßnahmen und Gesundheitsschutz bei Tätigkeiten mit diesen
Mikroorganismen am Arbeitsplatz bezieht. Es wird durch die genannten
Risikogruppen nicht das potentielle Risiko für den Verbraucher, zum Beispiel durch
den Verzehr von probiotischen Lebensmitteln, ausgedrückt.
37

38
Wissenschaftliches Schrifttum
Nach DE VRESE und SCHREZENMEIER (2000) haben Mikroorganismen der
Risikogruppe 1, die seit langer Zeit ohne Gesundheitsrisiken eingesetzt werden, den
sog. GRAS-Status („Generally Recognized as Safe“).
„Generally Recognized as Safe“ ist eine Bezeichnung der amerikanischen FDA
(Food and Drug Administration) für jede Substanz, die Lebensmitteln zugesetzt
werden kann, und von Experten als sicher eingestuft wurde (FDA 2004).
Das sog. QPS-Konzept der EFSA (European Food Safety Authority) ist in Konzeption
und Zweck ähnlich der in den USA verwendeten GRAS-Definition. QPS steht für
„Qualified Presumption of Safety of Micro-organisms in Food and Feed“. Das QPS-
Konzept ist speziell an die in Europa geltenden Rechtsnormen angepasst.
Um festzustellen, welche Möglichkeiten es gibt, ein System einzuführen, das mit dem
Konzept und der Zielsetzung der in den USA verwendeten GRAS-Definition
vergleichbar wäre, hatten die früheren wissenschaftlichen Ausschüsse der DG
SANCO (Directorate General for Health and Consumer Protection, European
Commission) für Lebensmittel, Futtermittel und Pflanzen 2003 gemeinsam ein
Arbeitspapier zur öffentlichen Beratung ausgearbeitet. Das Dokument zeigte einen
möglichen Weg auf, wie die Ansätze für die Sicherheitsbewertung von
Mikroorganismen in der Lebensmittel- und Futtermittelproduktion harmonisiert
werden könnten. Im Rahmen des zweiten wissenschaftlichen Kolloquiums der EFSA
im Dezember 2004 wurde über die wissenschaftlichen Grundsätze, die der „Qualified
Presumption of Safety“ zugrunde liegen, offen diskutiert.
Das QPS-Konzept stellt einen möglichen Weg dar, die Einschätzungen der
Sicherheit von Mikroorganismen, die in Lebensmitteln und Futtermitteln Verwendung
finden, über die Ausschüsse der EFSA hinaus zu harmonisieren. QPS erlaubt es, die
für eine adäquate Sicherheitsbewertung von Lebensmitteln und Futtermitteln
erforderlichen Elemente zu identifizieren. Auf diese Weise sollen Ressourcen besser
genutzt werden, indem sich auf solche Organismen konzentriert werden kann, die die
größten Risiken oder Unsicherheiten darstellen (EFSA 2005).

Wissenschaftliches Schrifttum
Laktobazillen werden gelegentlich mit klinischen Erkrankungen in Zusammenhang
gebracht. Es handelt sich bei ihnen aber um opportunistische Erreger, die nur bei
Patienten mit schweren Grunderkrankungen klinisch in Erscheinung treten. Sie
können selbst nicht die Barrieren des Gastrointestinaltraktes oder anderer
Schleimhäute überwinden, d. h. sie sind nicht obligat pathogen (KLEIN et al. 1992,
AGUIRRE u. COLLINS 1993, GASSER 1994).
Trotz des GRAS-Status konnte vereinzelt bei Milchsäurebakterien ein
Zusammenhang mit verschiedenen Krankheitsbildern beobachtet werden (GASSER
1994). Nach KLEIN et al. (1992) und AGUIRRE und COLLINS (1993) ist das
allgemeine Infektionsrisiko bei Milchsäurebakterien aber als sehr niedrig einzustufen.
Klinische Infektionen, die durch Milchsäurebakterien verursacht wurden, konnten
nicht bei gesunden Personen beobachtet werden. In allen Fällen lagen
prädisponierende Faktoren für eine Infektion vor (ADAMS u. MARTEAU 1995).
Bei alten und immunsupprimierten Patienten, vor allem bei solchen, die
Breitspektrumantibiotika therapeutisch einnahmen, konnten z. B. durch Laktobazillen
bedingte infektiöse Endokarditiden, Septikämien, rheumatische Gefäßerkrankungen
sowie Zahnfäule diagnostiziert werden (HARTY et al. 1994). Speziell für die
infektiöse Endokarditis prädisponieren auch abnorme Herzklappenbefunde (ADAMS
u. MARTEAU 1995). Aus klinischen Proben von Patienten wurden als Laktobazillen
vor allem die Spezies L. paracasei und L. rhamnosus nachgewiesen (GASSER
1994). Nach KIRJAVAINEN et al. (1999) gelten die Fähigkeit zur
Blutplättchenaggregation und die Produktion bestimmter Endopeptidasen und
Glykosidasen durch Laktobazillen als Risikofaktoren. HARTY et al. (1994) und
KORPELA et al. (1997) zeigten, dass probiotisch genutzte Bakterien Eigenschaften,
wie z. B. Blutplättchenaggregation als spezifischen Pathogenitätsfaktor, nicht
besitzen.
Auch wenn Probiotika als „Generally Recognized as Safe“ angesehen werden,
können unter bestimmten Bedingungen Risiken für den Menschen auftreten. Aus
diesem Grund wurde 1996 das sog. PRODEMO-Projekt von der Europäischen Union
39

40
Wissenschaftliches Schrifttum
gefördert. PRODEMO CT96-1028 (Program Demonstration of Nutritional
Functionality of Probiotic Foods) wurde mit dem Ziel initiiert, für die Wirkungen von
probiotischen Produkten wissenschaftliche Beweise zu liefern bzw. diese zu
überprüfen. Außerdem wurde eine Liste mit Sicherheitskriterien für probiotische
Lebensmittel festgelegt (DONOHUE 2004).
Die ARBEITSGRUPPE „PROBIOTISCHE MIKROORGANISMENKULTUREN IN
LEBENSMITTELN“ AM BUNDESINSTITUT FÜR GESUNDHEITLICHEN
VERBRAUCHERSCHUTZ UND VETERINÄRMEDIZIN (jetzt: BfR) (2000) sieht die
gesundheitliche Unbedenklichkeit bei den traditionell in Lebensmitteln eingesetzten
Milchsäurebakterien als ausreichend belegt an. Eine Unterscheidung in „sicher“ und
„nicht sicher“ muss demnach stammspezifisch und nicht speziesspezifisch getroffen
werden. Infektionen mit Milchsäurebakterien durch den Verzehr von probiotischen
Lebensmitteln konnten laut dieser Arbeitsgruppe nicht nachgewiesen werden. Seit
Jahrzehnten eingesetzte Mikroorganismen sind als sicher anzusehen. Neu
eingeführte Stämme müssen geprüft werden. Speziell sind die in Tabelle 10
aufgeführten Kriterien zu überprüfen.

Wissenschaftliches Schrifttum
Tabelle 10: Physiologische Kriterien von probiotischen Mikroorganismen, die
einer Unbedenklichkeitsprüfung bedürfen (ARBEITSGRUPPE
„PROBIOTISCHE MIKROORGANISMENKULTUREN IN
LEBENSMITTELN“ AM BUNDESINSTITUT FÜR
GESUNDHEITLICHEN VERBRAUCHERSCHUTZ UND
•
VETERINÄRMEDIZIN (jetzt: BfR) 2000)
Kriterien
Bildung von biogenen Aminen (insbes. Tyramin, Histamin, Phenylethylamin)
• Aktivierung von Prokanzerogenen (mit Hilfe von Azoreduktase, Nitroreduktase,
ß-Glucuronidase)
• Induktion bzw. Abbau von Thromben mit Hilfe spezifischer Hydrolasen
• Aktivierung der Thrombozytenaggregation
• Bindung an Fibrinogen und Fibronektin
• Mucinabbau (wurde in bestimmten Bifidobakterien nachgewiesen und kann als
Voraussetzung für eine Invasionstätigkeit der Mikroorganismen gewertet
werden)
• Hämolytische Aktivität
• Übertragbare Antibiotikaresistenzen
41

42
Wissenschaftliches Schrifttum
2.2 Fleischerzeugnisse und Gewürze
Es gibt eine Vielzahl von Fleischzubereitungen und Fleischerzeugnissen, denen die
unterschiedlichsten Gewürze zugesetzt werden. Im Folgenden sollen die
verschiedenen Begriffsdefinitionen in diesem Zusammenhang geklärt werden und
auf Gewürze, speziell deren antimikrobielle Wirkung, näher eingegangen werden.
Abschließend wird der Einsatz von Probiotika in Fleischerzeugnissen dargestellt.
2.2.1 Begriffsdefinitionen im Zusammenhang mit Fleischerzeugnissen
Die Begriffsbestimmungen, die im Zusammenhang mit Fleischerzeugnissen
festzulegen sind, sind in der Verordnung (EG) Nr. 853/2004 über spezifische
Hygienevorschriften für Lebensmittel tierischen Ursprungs (ANONYM 2004) im
Anhang I enthalten.
Nach dieser Verordnung sind „Fleisch“ (VO (EG) Nr. 853/2004, Anhang I, Nr. 1.1)
alle genießbaren Teile einschließlich des Blutes von „Huftieren“, „Geflügel“,
„Hasentieren“, „frei lebendem Wild“, „Farmwild“, „Kleinwild“ und „Großwild“. „Frisches
Fleisch“ (VO (EG) Nr. 853/2004, Anhang I, Nr. 1.10) wurde zur Haltbarmachung
ausschließlich gekühlt, gefroren oder schnellgefroren, kann vakuumverpackt oder in
kontrollierter Atmosphäre umhüllt sein.
„Fleischzubereitungen“ (VO (EG) Nr. 853/2004, Anhang I, Nr. 1.15): Frisches
Fleisch, einschließlich Fleisch, das zerkleinert wurde, dem Lebensmittel, Würzstoffe
oder Zusatzstoffe zugegeben wurden oder das einem Bearbeitungsverfahren
unterzogen wurde, das nicht ausreicht, die innere Muskelfaserstruktur des Fleisches
zu verändern und so die Merkmale des frischen Fleisches zu beseitigen.
„Fleischerzeugnisse“ (VO (EG) Nr. 853/2004, Anhang I, Nr. 7.1) sind verarbeitete
Erzeugnisse, die aus der Verarbeitung von Fleisch oder der Weiterverarbeitung
solcher verarbeiteter Erzeugnisse so gewonnen werden, dass bei einem Schnitt

Wissenschaftliches Schrifttum
durch den Kern die Schnittfläche die Feststellung erlaubt, dass die Merkmale von
frischem Fleisch nicht mehr vorhanden sind.
„Gelatine“ (VO (EG) Nr. 853/2004, Anhang I, Nr. 7.7) ist ein natürliches, lösliches
Protein, gelierend oder nichtgelierend, das durch die teilweise Hydrolyse von
Kollagen aus Knochen, Häuten und Fellen, Sehnen und Bändern von Tieren
gewonnen wird.
Nach § 2 Abs. 3 des Lebensmittel-, Bedarfsgegenstände- und
Futtermittelgesetzbuches (ANONYM 2005) sind Lebensmittel-Zusatzstoffe Stoffe mit
oder ohne Nährwert, die in der Regel weder selbst als Lebensmittel verzehrt noch als
charakteristische Zutat eines Lebensmittels verwendet werden, und die einem
Lebensmittel aus technologischen Gründen beim Herstellen oder Behandeln
zugesetzt werden, wodurch sie selbst oder ihre Abbau- oder Reaktionsprodukte
mittelbar oder unmittelbar zu einem Bestandteil des Lebensmittels werden oder
werden können. Den Lebensmittel-Zusatzstoffen stehen gleich
1. Stoffe mit oder ohne Nährwert, die üblicherweise weder selbst als Lebensmittel
verzehrt noch als charakteristische Zutat eines Lebensmittels verwendet werden und
die einem Lebensmittel aus anderen als technologischen Gründen beim Herstellen
oder Behandeln zugesetzt werden, wodurch sie selbst oder ihre Abbau- oder
Reaktionsprodukte mittelbar oder unmittelbar zu einem Bestandteil des
Lebensmittels werden oder werden können; ausgenommen sind Stoffe, die
natürlicher Herkunft oder den natürlichen chemisch gleich sind und nach allgemeiner
Verkehrsauffassung überwiegend wegen ihres Nähr-, Geruchs- oder
Geschmackswertes oder als Genussmittel verwendet werden,
2. Mineralstoffe und Spurenelemente sowie deren Verbindungen außer Kochsalz,
3. Aminosäuren und deren Derivate und
4. Vitamine A und D sowie deren Derivate.
43

2.2.2 Gewürze
44
Wissenschaftliches Schrifttum
Die Leitsätze für Gewürze und andere würzende Zutaten (ANONYM 1998) werden
nach § 15 LFGB (ANONYM 2005) von der Deutschen Lebensmittelbuch-Kommission
beschlossen und in das Deutsche Lebensmittelbuch aufgenommen. Die Leitsätze
beschreiben die Herstellung, Beschaffenheit oder sonstigen Merkmale von
Lebensmitteln, die für die Verkehrsfähigkeit der Lebensmittel von Bedeutung sind.
Die Leitsätze für Gewürze und andere würzende Zutaten (ANONYM 1998) definieren
Gewürze und Kräuter als Pflanzenteile, die wegen ihres Gehaltes an natürlichen
Inhaltsstoffen als geschmacks- und/oder geruchsgebende Zutaten zu Lebensmitteln
bestimmt sind.
Gewürze sind Blüten, Früchte, Knospen, Samen, Rinden, Wurzeln, Wurzelstöcke,
Zwiebeln oder Teile davon, meist in getrockneter Form.
Kräuter sind frische oder getrocknete Blätter, Blüten, Sprosse oder Teile davon.
Gewürzmischungen sind ausschließlich aus Gewürzen bestehende Mischungen.
Man bezeichnet Gewürze nach ihrer Art. Sofern der Zerkleinerungsgrad von
Bedeutung ist, wird dieser zusätzlich angegeben.
Nach den Leitsätzen für Gewürze und andere würzende Zutaten (ANONYM 1998)
werden bei Gewürzen die Verkehrsbezeichnungen kursiv geschrieben.
Bei Nelken/Gewürznelken handelt es sich z. B. um die kurz vor dem Aufblühen
gesammelten, getrockneten Blütenknospen von Syzygium aromaticum (L.) Merr. et
Perry aus der Familie der Myrtengewächse (Myrtaceae).
Schwarzer Pfeffer bezeichnet die noch nicht völlig reif geernteten, getrockneten
Früchte von Piper nigrum (L.) aus der Familie der Pfeffergewächse (Piperaceae). Sie
riechen kräftig aromatisch und scharf.
Wertbestimmende Inhaltsstoffe von Gewürzen, welche Geruch, Geschmack und
Farbe wesentlich bestimmen, sind neben ätherischen Ölen, Scharfstoffe (z. B.
Senföle), Bitterstoffe und Farbstoffe (TEUSCHER 2003).

Wissenschaftliches Schrifttum
Gewürze können auf verschiedene Art und Weise Verunreinigungen aufweisen, wie
z. B. Mikroorganismen sowie deren toxische Stoffwechselprodukte, Schwermetalle,
Pflanzenschutzmittel, Herbizide, Düngemittel, radioaktive Substanzen, Umweltgifte,
Insekten, Sand, Erde, Staub und fremde Pflanzenteile (TEUSCHER 2003). Die
Keimzahl von Kräutern und Gewürzen ist mit bis 10 7 KbE/g vergleichsweise hoch
(BECKMANN et al. 1996). Die kontaminierenden Mikroorganismen sind häufig
aerobe Sporenbildner und Schimmelpilze. Trotz relativ hoher Keimbelastungen sind
die Infektionsgefahren für den Menschen als gering einzuschätzen, da
Mikroorganismen in der Regel während der Herstellungs- und Kochprozesse
abgetötet werden (TEUSCHER 2003).
Während der Lagerung getrockneter Gewürze können Qualitätsminderungen wie
z. B. Verdunsten von flüchtigen Inhaltsstoffen, Abbau von Farbstoffen, Anreicherung
von Mikroorganismen und deren Toxinen auftreten (TEUSCHER 2003).
Gewürze können eine Vielzahl verschiedener pharmakologischer Wirkungen haben:
• appetitanregende und verdauungsfördernde (PLATEL u. SRINIVASAN 1996,
2000),
• antimikrobielle (YOUSEF u. TAWIL 1980, KNOBLOCH et al. 1986, KNOBLOCH
et al. 1989, TABAK et al. 1996, DORMAN u. DEANS 2000, NIELSEN u. RIOS
2000, INOUYE et al. 2001),
• karminative (SCHILCHER 1986),
• antioxidative und radikalfangende (ZITTERMANN 1994, ASAI et al. 1999,
ÖZCAN 2003, MORENO et al. 2006, YANISHLIEVA et al. 2006),
• antikarzinogene und antitumorale (FIALA et al. 1985, HECHT et al. 1995, CAI et
al. 1997, SUAEYUN et al. 1997, MARTÍNEZ et al. 1998, CHUANG et al. 2000),
• hepatoprotektive (YOUDIM u. DEANS 1999),
• antihypercholesterolämische und antiarteriosklerotische (TEUSCHER 2003),
• östrogene und gestagene (ZAVA et al. 1998),
• sowie zahlreiche sonstige Wirkungen (TEUSCHER 2003).
45

46
Wissenschaftliches Schrifttum
Unter Umständen können Gewürze auch toxische Wirkungen haben oder sogar
kanzerogen und hepatotoxisch sein, wobei in den zum Würzen üblichen Dosen
normalerweise keine Gefahr besteht (LAKE 1999). Allergische Reaktionen, die durch
Gewürze ausgelöst werden, können auch bei geringen Mengen vorkommen
(WÜTHRICH u. HOFER 1984, STAGER et al. 1991, WÜTHRICH u. ETESAMIFAR
1998, WÜTHRICH u. BLÖTZER 2004).
Gewürze dienen nicht nur der Verbesserung von Geruch, Geschmack und Aussehen
von Speisen, sondern können auch aufgrund der antioxidativen und antimikrobiellen
Wirkungen zur Verbesserung der Haltbarkeit der Lebensmittel führen (TSAI et al.
1999, TEUSCHER 2003).
2.2.2.1 Antimikrobielle Wirkung von Gewürzen
Alle Gewürze mit ätherischen Ölen und isolierte ätherische Öle wirken mehr oder
weniger stark antimikrobiell. Die Komponenten ätherischer Öle lagern sich aufgrund
ihrer Lipophilität in die Zellmembranen der Mikroorganismen ein und hemmen u. a.
den membrangebundenen Elektronenfluss bei der oxidativen Phosphorylierung und
damit den Energiestoffwechsel. Hohe Konzentrationen an ätherischen Ölen führen
auch zur Lyse der Zellmembranen und zur Denaturierung der Cytoplasmaproteine.
Viele ätherische Öle oder ihre Komponenten haben eine mit der von Phenol
vergleichbare oder diese sogar übertreffende Desinfektionswirkung. Der sog.
Phenolkoeffizient beschreibt die abtötende Wirkung auf ein bestimmtes
Testbakterium im Vergleich zu Phenol (Phenol = 1) (TEUSCHER 2003).
Die antimikrobiell wirksamen Inhaltsstoffe von Gewürzen werden als Phytonzide
bezeichnet. Phytonzide sind pflanzliche Stoffwechselprodukte (GERHARDT 1990).
Bei zahlreichen Gewürzen sind die ätherischen Öle Träger der antimikrobiellen
Wirksamkeit (NARAHIMSARAO u. NIGAM 1970).

Wissenschaftliches Schrifttum
Ätherische Öle sind sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe, leicht flüchtig, und stellen meist
komplizierte Gemische verschiedener, oft nahe verwandter Stoffe dar, die auch in
sehr großen Verdünnungen durch Geruch und Geschmack zu erkennen sind. Der
Gehalt an ätherischen Ölen in verschiedenen Gewürzen variiert. Ätherische Öle
lassen sich durch organische Lösungsmittel, wie Alkohol, aus der Pflanze
extrahieren. Unter Luft- und Lichteinwirkung unterliegen die ätherischen Öle leicht
der Autoxidation, sie „verharzen“ und nehmen artfremden Geruch an; verschiedene
Inhaltsstoffe können auch polymerisieren. Ätherische Öle sind aus den
Grundelementen Kohlenstoff, Wasserstoff, eventuell noch aus Sauerstoff, Stickstoff
und Schwefel aufgebaut. Man unterscheidet aliphatische, aromatische und
alicyclische Stoffgruppen (GERHARDT 1990).
In der Gewürzbranche werden die ätherischen Öle auch als Gewürzöle bezeichnet
(TEUSCHER 2003). Die Zusammensetzung des ätherischen Öls einer Pflanze ist
sehr komplex. Der Dampfdruck eines flüchtigen Stoffes bei Zimmer- oder
Körpertemperatur bestimmt wie stark dieser zum Aroma eines Gewürzes beiträgt.
Durch AEDA (aroma extract dilution analysis) werden die FD-Faktoren (flavour
dilution-Faktoren) bestimmt, die angeben, bei welcher Verdünnung der abgetrennte
Stoff noch geruchlich wahrgenommen werden kann (GROSCH 1993, 1994).
Gewürznelken enthalten 15 bis 21 % ätherisches Öl. Die Hauptkomponenten, die
etwa 99 % ausmachen, sind Eugenol (70 bis 90 %), Acetyleugenol/Eugenylacetat
(bis 17 %) und ß-Caryophyllen (5 bis 12 %). In sehr geringen Mengen kommen
zahlreiche weitere Komponenten vor, davon sind Heptan-2-on (Methylamylketon)
und Octan-2-on (Methylheptylketon) maßgeblich am Geruch beteiligt (WALTER
1972, KOLLER 1981, GOPALAKRISHNAN et al. 1990, TEUSCHER 2003). Längere
Lagerung hat zur Folge, dass bedingt durch die Bildung von Methylacetat aus der
Seitenkette des Acetyleugenols, unerwünschte Aromaveränderungen auftreten
(KOLLER 1979). Extrakte aus Gewürznelken und Nelkenöl besitzen gute
antimikrobielle Wirkung (HITOKOTO et al. 1980, BRIOZZO et al. 1989, BEUCHAT
1994, DORMAN u. DEANS 2000). Auch das Wachstum von Helicobacter pylori wird
47

48
Wissenschaftliches Schrifttum
gehemmt, dessen Urease-Aktivität jedoch nicht beeinflusst (BAE et al. 1998). An der
gegen pathogene Mundbakterien gerichteten antibakteriellen Wirkung sind auch die
Flavone Kämpferol und Myricetin beteiligt (CAI u. WU 1996). Das Wachstum
mycotoxigener Pilze und deren Mycotoxinbildung wird bereits durch 0,1 %
Nelkenpulver im Substrat völlig unterdrückt (MABROUK u. EL-SHAYEP 1980).
Im Schwarzen Pfeffer liegt der Gehalt an ätherischen Ölen zwischen 1,2 und 3,9 %.
Hauptkomponenten können ß-Caryophyllen (12 bis 47 %), α-Pinen (2 bis 25 %),
Sabinen (0 bis 25 %), (+)-Limonen (9 bis 23 %), ∆ 3 -Caren (0,1 bis 20 %), ß-Pinen
(2 bis 15 %), α-Phellandren (0,1 bis 10%) und Myrcen (0 bis 8%) sein
(DEBRAUWERE u. VERZELE 1976, SUMATHYKUTTY et al. 1999, TEWTRAKUL et
al. 2000, TEUSCHER 2003). Ethanolische Pfefferextrakte oder ätherisches Pfefferöl
wirken antibakteriell (HUHTANEN 1980, MABROUK u. EL-SHAYEP 1980, ISMAIEL
u. PIERSON 1990, PEREZ u. ANESINI 1994, DORMAN u. DEANS 2000). Das
Wachstum mycotoxigener Schimmelpilze wird aber offenbar nicht beeinflusst, da
Pfeffer hohe Konzentrationen an Aflatoxinen enthalten kann (ROY et al. 1988,
EL-KADY et al. 1995).
COVENTRY und HICKEY (1993) beschrieben, dass Gewürze die Entwicklung
bestimmter Mikroorganismen fördernd oder hemmend beeinflussen können.
Demnach kann eine angemessene Konzentration von Mangan-Ionen im Gewürz die
Fermentationsprozesse verstärken; im Gegensatz dazu werden
fermentationshemmende Effekte auf das Wirken von in Gewürzextrakten
vorhandenen antimikrobiellen Verbindungen zurückgeführt.
ÖZCAN und ERKMEN (2001) untersuchten die Wirkung der ätherischen Öle
verschiedener Gewürze auf unterschiedliche Testbakterien. Die ätherischen Öle
variierten in ihrer antimikrobiellen Aktivität. Einzelne oder Kombinationen von
ätherischen Ölen könnten effizient für die Inaktivierung von pathogenen
Mikroorganismen und Verderbniserregern sein, um so eine ausreichende
Lagerfähigkeit von Lebensmitteln zu erreichen.

Wissenschaftliches Schrifttum
Ingwer, Roter Pfeffer, Senf, Muskat, Zimt und Nelken wurden untersucht, um ihre
Effekte auf das Wachstum und die Säureproduktion einer Starterkultur, bestehend
aus L. plantarum und P. cerevisiae, in einem flüssigen Medium festzustellen. 4,0 g/l,
8,0 g/l und 12,0 g/l aller Gewürze, mit Ausnahme von Nelken, stimulierten die
Säureproduktion durch die Starterkultur, führten aber nicht zu Zunahmen in der
Bakterienpopulation. Nelken hemmten die Starterkultur ab 4,0 g/l, niedrigere
Konzentrationen (0,5 - 2,0 g/l) stimulierten die Säureproduktion. Hohe
Zimtkonzentrationen (8,0 - 12,0 g/l) verzögerten die Säureproduktion, aber die
Bakterienzahl war mit der der Kontrolle vergleichbar (ZAIKA u. KISSINGER 1979).
ZAIKA et al. (1983) bewiesen, dass zunehmende Konzentrationen (0,5 - 8,0 g/l) an
Oregano, Rosmarin, Salbei und Thymian progressiv das Wachstum und die
Säureproduktion von L. plantarum und P. acidilactici in einem flüssigen Medium
verzögern. Nach Überwinden der bakteriostatischen Aktivität, stimulierten alle vier
Gewürze heftig die Säureproduktion. Für den relativen inhibitorischen Effekt der
Gewürze gegenüber beiden Mikroorganismen konnte folgende Reihenfolge
festgelegt werden: Oregano >> Rosmarin = Salbei > Thymian. L. plantarum erwies
sich gegenüber der toxischen Effekte der Gewürze resistenter als P. acidilactici.
ZAIKA und KISSINGER (1981) konnten zeigen, dass der inhibitorische Effekt von
Oregano durch Extraktion mit Lösungsmitteln oder Autoklavieren beseitigt werden
kann.
Die Wirkungen von Kümmel und Oregano sowie ihrer ätherischen Öle untersuchten
KIVANÇ et al. (1991). Kümmel in Konzentrationen von 0,5 %, 1,0 % und 2,0 %
stimulierte das Wachstum und die Säureproduktion von L. plantarum und
Leuconostoc mesenteroides in flüssigem Medium. Das ätherische Öl von Kümmel
hemmte in hohen Konzentrationen (300 und 600 ppm) Wachstum und
Säureproduktion von L. plantarum. Nach einer bestimmten Zeit konnte Wachstum
von Leuconostoc mesenteroides beobachtet werden, und dessen Säureproduktion
wurde bei 600 ppm stimuliert. Oregano und seine ätherischen Öle hemmten in allen
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50
Wissenschaftliches Schrifttum
Konzentrationen das Wachstum beider Kulturen. Die Säureproduktion von
L. plantarum wurde hingegen durch Oregano stimuliert.
GONZALEZ-FANDOS et al. (1996) konnten nachweisen, dass Knoblauch und
Oregano in Konzentrationen über 2 % eine antimikrobielle Wirkung auf in der
Wurstfermentation eingesetzte Laktobazillen (L. plantarum DSM 20174, L. curvatus
DSM 20019, L. sakei DSM 20017) und Pediokokken (P. damnosus DSM 20031)
ausüben. Ähnliche Verhältnisse ergaben sich bei Paprika und Pfeffer in
Konzentrationen von 5 %.
Nach GROHS et al. (2000) verzögert die Anwendung zweier Gewürzmischungen das
bakterielle Wachstum auf Schweinefleisch, unterbindet es jedoch nicht vollständig.
Von Pseudomonaden, Enterobacteriazeen und Milchsäurebakterien als potentielle
und häufig anzutreffende Verderbniserreger auf Frischfleisch, konnte die Zunahme
der Keimzahlen von Pseudomonaden und Enterobacteriazeen durch die Anwendung
der Gewürzmischungen verlangsamt werden. Somit war das Fleisch im
Wesentlichen mikrobiell stabil. Die Vermehrung der Milchsäurebakterien blieb
weitgehend unbeeinflusst.
2.2.3 Einsatz von Probiotika in Fleischerzeugnissen
Die Idee, Lebensmittel eher gezielt für gesundheitsfördernde Zwecke zu nutzen, als
aus ernährungsphysiologischen Gründen, eröffnete ein ganz neues Feld für die
Fleischindustrie. Zusätzlich zu traditionellen Produkten könnten sog. „design“-
Lebensmitel mit bestimmten Eigenschaften und funktionellen Inhaltsstoffen, wie z. B.
Probiotika, produziert werden. Die kontinuierliche Bioverfügbarkeit der funktionellen
Inhaltsstoffe ist während der verschiedenen Stadien der Herstellung und der
Lagerung sicherzustellen (JIMÉNEZ-COLMENERO 2001).

Wissenschaftliches Schrifttum
Obwohl Milchsäure produzierende Bakterien als Starterkulturen in der Herstellung
von fermentierten Fleischprodukten weit verbreitet sind, wurde bisher wenig Wert auf
deren Eignung als Probiotika in Fleischprodukten gelegt, im Gegensatz zu der
Situation bei Milcherzeugnissen (ARIHARA 2004). INCZE (2002) nennt als Ursache
für diese Verspätung grundsätzliche Unterschiede zwischen diesen beiden
Produktgruppen. Bei Fleischerzeugnissen gibt es demnach keine Möglichkeit, die
Anfangskeimzahl des Wurstbrätes drastisch zu senken, wie dies bei der
Milchpasteurisierung der Fall ist. Außerdem liegt der aw-Wert einer fertigen Rohwurst
wesentlich niedriger als der von probiotischen Molkereiprodukten, was nur wenige
probiotische Bakterien vertragen (INCZE 2002). Dennoch erscheint es möglich,
Fleischerzeugnisse zu entwickeln, die nützlich für die Gesundheit sind, indem
probiotische Bakterien verwendet werden (ARIHARA 2004).
Starterkulturen sind reine Bakterienkulturen, die, allein oder zusammen mit anderen
reinen Kulturen, bei der Herstellung von Wurstwaren zugefügt werden, mit dem Ziel
eine kontrollierte Fermentation herbeizuführen. Die Starterkulturmischung ist je nach
Hersteller gefroren oder gefriergetrocknet, mit oder ohne Trägerstoff. Die Einzeloder
Mischkulturen ausgewählter Stämme lebender Mikroorganismen haben
bestimmte lebensmitteltechnologisch bedeutsame enzymatische Eigenschaften.
Hierdurch sollen Aroma, Farbe und Konsistenz positiv beeinflusst werden, und somit
eine gleichbleibende Qualität, sowie in mikrobiologischer Hinsicht stabile, sichere
Produkte erzielt werden (CORETTI 1977, METZ 1993, GEISEN et al. 1992, KNAUF
1998, RUST 2004). Mikroorganismen, die als Starterkulturen eingesetzt werden
sollen, müssen in der Lage sein, in dem entsprechenden Milieu zu wachsen bzw. zu
überleben (KNAUF 1997).
Nach RUST (2004) häufig in der Fleischindustrie eingesetzte Starterkulturen sind in
Tabelle 11 dargestellt.
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Wissenschaftliches Schrifttum
Tabelle 11: Häufig in der Fleischindustrie eingesetzte Starterkulturen
(RUST 2004)
Gruppe Spezies
Milchsäurebakterien Lactobacillus sakei/curvatus
Lactobacillus plantarum
Pediococcus cerevisiae
Pediococcus acidilactici
Pediococcus pentosaceus
Nitrat reduzierende Bakterien Kocuria varians
Staphylococcus carnosus
Staphylococcus xylosus
Hefen Debaryomyces hansenii
Schimmelpilze Penicillium nalgiovense
Penicillium camemberti
Penicillium chrysogenum
Die aus Fleisch isolierten Lactobacillus-Stämme erwiesen sich als geeignete
Starterkulturen für die Herstellung von fermentierten Rohwürsten und produzierten
zufriedenstellende Produkte, stärker abhängig vom verwendeten Stamm als von der
Spezies (GARRIGA et al. 1996).
Zwischen verschiedenen Bakterienspezies kommt es zu Konkurrenz, vorausgesetzt,
dass die physikalischen Umgebungsbedingungen, wie z. B. Temperatur und pH-
Wert, ein Wachstum ermöglichen. Das schnellere Wachstum von
Milchsäurebakterien und die Verringerung des pH-Wertes aufgrund der Produktion
von Milchsäure führen in mikrobiologischer Hinsicht zu stabilen fermentierten
Produkten. Dieses Basisphänomen der Bakterienökologie wird für die Herstellung
von Fleischprodukten, wie z. B. Wurstwaren, benutzt. Für die Wurstherstellung wird
mit Starterkulturen, wie z. B. L. plantarum, beimpft. Die erste Inkubationsperiode
ermöglicht es den Bakterien zu wachsen, wobei Zeit und Temperatur an die jeweilige
Technologie angepasst werden, und die Verringerung des pH-Wertes wird

Wissenschaftliches Schrifttum
gemessen. Anschließend werden die Produkte gekühlt und für die Reifung gelagert,
um das Endprodukt zu erhalten (MÄYRÄ-MÄKINEN u. BIGRET 2004).
Nach HAMMES und HALLER (1998) können Mikroorganismen mit Lebensmitteln
verzehrt und probiotisch wirksam werden. Hierfür ist grundsätzlich jedes
Lebensmittel geeignet, das die definierten Keime am Leben hält. Allerdings muss der
Einfluss des Lebensmittels auf das Überleben und die Erhaltung der probiotischen
Wirksamkeit bekannt sein, wobei nach HAMMES und HALLER (1998) für Rohwürste
noch keine relevanten wissenschaftlichen Untersuchungsergebnisse vorlagen. Es ist
nicht sicher, ob ein Stamm, dessen probiotische Wirkung in Milcherzeugnissen
nachgewiesen wurde, diese auch in Fleischerzeugnissen besitzt (HAMMES u.
HALLER 1998, HAMMES u. HERTEL 1998).
ARIHARA et al. (1998) untersuchten probiotische Stämme aus der Lactobacillus
acidophilus-Gruppe (L. acidophilus, L. crispatus, L. amylovorus, L. gallinarum,
L. gasseri, L. johnsonii) hinsichtlich ihrer Anwendung bei der Fermentation von
Fleisch. Von sechs Stämmen zeigte L. gasseri JCM1131 T die größte
Fermentationsleistung. Dieser Stamm war gegen Magen- und Gallensäure resistent
und sollte so keine nachteiligen Einflüsse auf die Intestinalflora haben. Außerdem
konnte durch diesen Stamm die Vermehrung von S. aureus und dessen
Enterotoxinbildung herabgesetzt werden. ARIHARA et al. (1998) kamen zu dem
Schluss, dass Milchsäurebakterien effektiv in der Fleischfermentation eingesetzt
werden können, um gesundheitsfördernde Produkte herzustellen.
ERKKILÄ et al. (2001 a, b) untersuchten die Fähigkeit dreier probiotischer
Lactobacillus rhamnosus Stämme (GG, E-97800 und LC-705), sowie als Kontrolle
die Fähigkeit einer kommerziell erhältlichen Starterkultur, Pediococcus pentosaceus,
Rohwürste zu fermentieren. Während der Fermentation stiegen die Konzentrationen
der Milchsäurebakterien von 7 lg KbE/g auf 8 - 9 lg KbE/g an, und die pH-Werte
sanken von 5,6 auf 4,9 - 5,0. Die eingesetzten Starterkulturen stellten jeweils die
dominierenden Mikroorganismen im Produkt dar. Sensorisch betrachtet war der
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54
Wissenschaftliches Schrifttum
naso-orale Gesamteindruck (Flavour) bei den Produkten, die von GG und E-97800
fermentiert wurden, vergleichbar mit dem der als Kontrollstamm eingesetzten
Starterkultur, bei LC-705 hingegen minderwertiger. Die ausgewählten Stämme
produzierten keine biogenen Amine. ERKKILÄ et al. (2001 a, b) kamen zu der
Erkenntnis, dass die untersuchten probiotischen Stämme Lactobacillus rhamnosus
GG, E-97800 und LC-705 für die Rohwurstherstellung geeignet erscheinen. Wie aber
auch schon HAMMES und HALLER (1998) postulierten, können auch nach ERKKILÄ
et al. (2001 a, b) positive gesundheitliche Wirkungen von Probiotika in
Milcherzeugnissen nicht pauschal auf Fleischerzeugnisse übertragen werden.
Klinische Studien zur Bestimmung der Wirkungen von probiotischen Rohwürsten
wären notwendig.
Außerdem konnten ERKKILÄ und PETÄJÄ (2000) und ERKKILÄ (2001) zeigen, dass
gewöhnlich in Fleisch eingesetzte kommerzielle Starterkulturen in-vitro die
Einwirkung von Magen- und Gallensäure überlebten. Stämme von Lactobacillus
sakei (RM 10) und Pediococcus acidilactici (P 2) zeigten dabei die besten
Überlebensraten bei niedrigen pH-Werten und hohen Konzentrationen an
Gallensäure (ERKKILÄ u. PETÄJÄ 2000, ERKKILÄ 2001).
Nach TYÖPPÖNEN et al. (2003) können Milchsäurebakterien sowohl als Probiotika,
als auch als bioprotektive Kulturen und als fermentierende Substanzen in
Fleischprodukten, wie z. B. Rohwürsten, eingesetzt werden.

Wissenschaftliches Schrifttum
2.3 Technologische Verfahren zur Bakterienbearbeitung
Die Stabilität von Mikronährstoffen bzw. bioaktiven Komponenten, z. B. Probiotika,
variiert bei unterschiedlichen Milieubedingungen. Dies ist bei der Anreicherung in
Lebensmitteln zu berücksichtigen, und somit sind u. U. spezielle technologische
Maßnahmen zur Verbesserung des Erhaltungsgrades notwendig. Es sind negative
äußere wie innere Einflüsse zu vermeiden. Bei den technologischen Maßnahmen ist
zu berücksichtigen, dass die entsprechenden Inhaltsstoffe ggf. unterschiedlich
freigesetzt werden sollen, z. B. in bestimmten Abschnitten des Verdauungstraktes.
Die Herstellung von Functional Food erfordert daher nicht nur bestimmte
Maßnahmen zur Absicherung des deklarierten Gehaltes an biologisch wirksamen
Inhaltsstoffen, sondern auch die Absicherung des ausgelobten
gesundheitsbezogenen Effektes. Somit gewinnen Verfahrensschritte eine besondere
Bedeutung, wenn diese einerseits zur Erhaltung empfindlicher Inhaltsstoffe führen
und andererseits die Einstellung einer kontrollierten Freisetzung bestimmter
Inhaltsstoffe im Verdauungstrakt ermöglichen sollen (MUSCHIOLIK u. NAUMANN
2002).
Im Folgenden werden als technologische Verfahren die Fermentation sowie die
Lyophilisation kurz angesprochen und die Mikroverkapselung ausführlich dargestellt.
2.3.1 Fermentation
Der Begriff Fermentation wird in der Mikrobiologie, Mykologie, Pharmazie und
Fütterung gebraucht, steht aber auch allgemein für jegliche technische Bioreaktion.
Eine Fermentation ist eine enzymkatalysierte biologische Stoffumwandlung. Als
Biokatalysatoren werden Enzyme, Mikroorganismen, pflanzliche und tierische
55

56
Wissenschaftliches Schrifttum
(humane) Zellkulturen verwendet. Sie können aggregiert oder immobilisiert vorliegen
(DELLWEG et al. 1992).
Jeder Fermentationsprozess ist durch die Fermentationsparameter (z. B.
Temperatur, pH-Wert, Wasseraktivität), die Art und Zusammensetzung des
Substrates (fest, flüssig, gasförmig), die Verfügbarkeit von Sauerstoff und die Art des
Stofftransportes charakterisiert. Der Stoffaustausch zwischen Mikroorganismus und
Umgebung steht in unmittelbarem Zusammenhang mit dem Stofftransport, der
diffusiv oder konvektiv erfolgen kann (KUNZ 1988).
Für ein allgemeingültiges Klassifikationssystem der Fermentationsprozesse ist die
Formulierung eindeutig definierter Kriterien, die die Relationen zwischen
Biokatalysator und umgebenden Phasen charakterisieren, notwendig.
Klassifikationskriterien für Fermentationsprozesse sind die Art des dispersen
Systems im Bilanzraum, die Verteilung zwischen Biokatalysator und Substrat, die Art
des Stofftransportes, die Verfügbarkeit des Sauerstoffes, charakteristische
limitierende Faktoren, Bindungsformen des Wassers, Bindungsformen des
Biokatalysators, der Stoffwechseltyp des Biokatalysators und die Viskosität der
charakteristischen Phasen (KUNZ et al. 2005).
Die Fermentationsprozesse lassen sich grundsätzlich in Abhängigkeit des
Verteilungszustandes der beteiligten Phasen in disperse Fermentationsprozesse
(homogene Fermentationsprozesse) und Oberflächen-Fermentationsprozesse
(heterogene Fermentationsprozesse) unterteilen. Zu den dispersen
Fermentationsprozessen gehören die Submersfermentation, die Slurry-Fermentation
und die Solid-State-Fermentation. Den Oberflächen-Fermentationsprozessen ordnet
man die Solid-Phase-Fermentation, gasförmig (Emersfermentation), die Solid-Phase-
Fermentation, flüssig, und die Liquid-Phase-Fermentation zu (KUNZ et al. 2005).
Die Submersfermentation bezeichnet alle Fermentationsprozesse, bei der
Biokatalysatoren und evtl. feste Substratpartikel sich in einer Nährlösung homogen
verteilt befinden (KUNZ et al. 2005).

Wissenschaftliches Schrifttum
Der Slurry-Fermentation werden alle Fermentationsprozesse zugeordnet, bei denen
sich Feststoffpartikel in einer kontinuierlichen flüssigen Phase befinden und der
Stofftransport überwiegend durch Diffusion erfolgt (KUNZ et al. 2005).
Die Solid-State-Fermentation wird gekennzeichnet durch das Fehlen der freien
(makroskopischen) Wasserphase und die Immobilisierung des Biokatalysators auf
einem festen Trägermaterial (KUNZ et al. 2005).
Die Solid-Phase-Fermentation, gasförmig (Emersfermentation), ist dadurch
charakterisiert, dass der Biokatalysator auf einer festen Oberfläche immobilisiert und
von einer Gasphase umgeben ist, wobei beide Phasen als makroskopische Phasen
getrennt voneinander vorliegen (KUNZ et al. 2005).
Bei der Solid-Phase-Fermentation, flüssig, ist der Biokatalysator auf einem festen
Substrat oder inerten Träger immobilisiert, und der Stoffaustausch mit der flüssigen
Phase erfolgt diffusiv oder konvektiv (KUNZ et al. 2005).
Die Liquid-Phase-Fermentation ist dadurch gekennzeichnet, dass der Biokatalysator
auf einer flüssigen Oberfläche immobilisiert und von einer Gasphase umgeben ist.
Beide Phasen liegen als makroskopische Phasen getrennt voneinander vor (KUNZ et
al. 2005).
Neben den aufgeführten Fermentationsprozessen gibt es auch solche, bei denen
sich verschiedene Fermentationsprozesse überschneiden. Es können in dem Fall
nicht alle Fermentationsprozesse einer Fermentationsart eindeutig zugeordnet
werden (KUNZ et al. 2005).
2.3.2 Lyophilisation
Die Lyophilisation (auch Lyophilisieren oder Gefriertrocknung) ist in vielen
Industriezweigen etabliert. Zum Einsatz kommt die Lyophilisation z. B. in der
pharmazeutischen Industrie und in der Lebensmittelindustrie. Bei der Herstellung von
Lebensmitteln steht vor allem die Aroma- und Geschmackserhaltung im Vordergrund
(HARTUNG 1993).
57

58
Wissenschaftliches Schrifttum
Die Lyophilisation stellt ein besonders schonendes Verfahren dar, um thermolabile
Stoffe von Wasser zu befreien. Bei der Gefriertrocknung wird ein Feststoff produziert,
in dem die molekulare Mobilität nahezu vollständig eingeschränkt ist. Es werden
somit physikalische und chemische Verfahren verhindert und kinetische
Umbauprozesse durch den Entzug von Wasser verlangsamt (PIKAL 1999).
Durch die Gefriertrocknung entstehen hochporöse, oftmals amorphe Kuchen mit
einer großen Oberfläche, die sich sehr schnell wieder auflösen. Bei der Lyophilisation
nutzt man aus, dass Wasser in gefrorenem Zustand über einen Dampfdruck verfügt,
der es vom festen direkt in den gasförmigen Zustand übergehen lässt (Sublimation).
Die Sublimationsfähigkeit von Eis bildet die Grundlage der Gefriertrocknung. Die
Lyophilisation beinhaltet das Einfrieren einer Lösung, das Sublimieren des
Lösungsmittels im Vakuum und die Entfernung von non-frozen Wasser
(ZIMMERMANN 1998).
Der Ablauf der Lyophilisation wird in drei Abschnitte unterteilt: 1. Einfrieren,
2. Primär- oder Haupttrocknung und 3. Sekundär- oder Nachtrocknung (ECKHARDT
1993, RUPPRECHT 1993).
Beim Einfrieren wird die Lösung in den festen Zustand überführt. Die Temperatur
wird abgesenkt. Unterhalb des Gefrierpunktes kristallisiert Wasser als Eis aus und
die Lösung konzentriert auf (ECKHARDT 1993).
Bei der Primär- oder Haupttrocknung wird ein Vakuum angelegt. Unter vermindertem
Druck sublimieren die in der Einfrierphase entstandenen Eiskristalle, wobei durch
beheizte Stellflächen die dazu nötige Energie bereitgestellt wird (ECKHARDT 1993).
Die Sekundär- oder Nachtrocknung sorgt dafür, dass das Restwasser (5 - 30 %), das
physikalisch oder chemisch in Form von Hydrat-, Quellungs- oder
Konstitutionswasser adsorbiert ist, entfernt und das Produkt auf die gewünschte
Endfeuchte getrocknet wird. Dazu wird das Vakuum und die Stellflächentemperatur
erhöht. Praktisch lässt sich der Restwassergehalt auf bis zu 0,1 % absenken, bei
komplexen Materialien ist es jedoch notwendig, dass eine bestimmte Restfeuchte
von ca. 2 - 5 % erhalten bleibt um die Strukturen zu stabilisieren (ECKHARDT 1993).

Wissenschaftliches Schrifttum
Unter Umständen müssen den zu lyophilisierenden Lösungen sog. Hilfsstoffe
zugesetzt werden, um eine ausreichende Konzentration und Aktivität der Stoffe im
Lyophilisat zu erreichen.
Eine wichtige Hilfsstoffgruppe stellen die „Bulking Agents“ dar, welche bei geringen
Konzentrationen des zu lyophilisierenden Stoffes, lediglich als Füllstoffe eingesetzt
werden. Diese Zusatzstoffe müssen keine Schutzfunktionen erfüllen, sollen lediglich
für einen mechanisch stabilen Kuchen sorgen (JENNINGS 1997).
Man unterscheidet unter den stabilisierenden Zusätzen die sog. Kryoprotektoren und
die sog. Lyoprotektoren. Die Kryoprotektoren wirken während der Einfrierphase, die
Lyoprotektoren hingegen während der Trocknungsphase schützend (ECKHARDT
1993).
2.3.3 Mikroverkapselung
KUNZ et al. (2003) definieren als Mikroverkapselung einen Prozess zum
vollständigen oder partiellen Einschluss kleiner Feststoffpartikel, Flüssigkeitstropfen
oder Gasen in Kapseln, die ihren Inhalt in kontrollierten Raten unter spezifischen
Bedingungen freisetzen können. Zweck der Mikroverkapselung ist nach KUNZ et al.
(2003) im Zusammenhang mit Lebensmitteln der Schutz des verkapselten Materials
oder des aufnehmenden Lebensmittels vor verschiedenen schädlichen Einflüssen.
2.3.3.1 Aufbau und Materialien
Die Umhüllung von festen, flüssigen und gasförmigen Stoffen wird allgemein als
Verkapselung bezeichnet. Der Kapselinhalt wird von einer festen Hülle umgeben
(HOBEIN u. LUTZ 1989).
59

60
Wissenschaftliches Schrifttum
Je nach Partikelgröße werden die Kapseln als Makrokapseln (> 5000 µm),
Mikrokapseln (0,2 - 5000 µm bzw. im engeren Sinne 0,2 - 1000 µm) oder
Nanokapseln (< 0,2 µm) bezeichnet (MUSCHIOLIK u. NAUMANN 2002).
Bei der Morphologie der verkapselten Teilchen sind nach RUNGE (2001)
grundsätzlich fünf verschiedene Typen zu unterscheiden (Abb. 1).
Kernmaterial
Kapselmaterial
a) b) c) d) e)
a) einfache Mikrokapsel, b) zwiebelschalenartige Mikrokapsel, c) Multi-Kern Mikrokapsel,
d) Matrixteilchen, e) irregulär geformte Mikrokapsel
Abbildung 1: Morphologie mikroverkapselter Teilchen nach RUNGE (2001)
Nach RUNGE (2001) kommen für die Mikroverkapselung verschiedene
Materialgruppen zum Einsatz. Grundsätzlich lassen sich die Materialien einteilen in
hydrophile und hydrophobe Substanzen. Zu den hydrophilen Materialien gehören
Kohlenhydrate und Proteine. Die Kohlenhydrate lassen sich in unmodifizierte und
modifizierte Kohlenhydrate unterteilen, sowie in Gummi. Es ist zwischen pflanzlichen
und tierischen Proteinen zu unterscheiden. Zu den hydrophoben Materialien gehören
Wachse, Lipide und Polymere.
Als Matrix- und Verkapselungsmaterialien stehen z. B. folgende Rohstoffe zur
Verfügung (MUSCHIOLIK u. NAUMANN 2002).

• Zucker
o Saccharose
o Laktose
o Sprühgetrockneter Glukosesirup
• Polysaccharide
Wissenschaftliches Schrifttum
o Stärke (Stärke, Amylose oder Amylopektin modifiziert)
o Maltodextrin mit unterschiedlichem Dextroseäquivalent (DE < 20)
o Na-Alginat
o Pektin (hoch- und niedrigverestert, amidiert)
o Agar-Agar
o Gellan
• Proteine
o К-Carrageenan
o Zellulosederivate
o Cyclodextrine
o Pflanzengummi
o Gelatine
o Gliadin
� Gummi arabicum
o Milchproteine
� Milchpulver (Mager-, Buttermilchpulver)
� Caseinate
� Molkenproteine
• Poly-L-Lysinhydrochlorid
• Lipide
o Pflanzliche Öle, Triglyceride fraktionierter Pflanzenfettsäuren C 8
o Pflanzliche Öle gehärtet, essbare Fette
o Essbare Wachse
o Modifizierte Lipide (Fettsäureester)
o Phospholipide (insbesondere Phosphatidylcholin für Liposomen)
61

62
Wissenschaftliches Schrifttum
Je nach Verkapselungsmethode können Mikrokapseln einzeln oder als
Kaspelagglomerate anfallen und als trockenes, frei fließendes Pulver oder als
Kapselsuspension (= Kapselslurry) weiterverwendet werden. Verkleben die
Kapselwände miteinander, so wird die Kapselmasse in Form von Briketts eingesetzt.
Die Wahl der Verkapselungsmethode richtet sich, ebenso wie die Auswahl der
Materialien, nach der Verwendungsform und dem Anwendungsbereich (HOBEIN u.
LUTZ 1989).
Je nach Herstellungs- und Anwendungsprofil der Mikrokapseln unterscheiden sich
die Kapseln in Kapselform, -aufbau, -größe, in der Zusammensetzung von
Wandmaterial und Kapselinhalt sowie bezüglich der physikalischen, chemischen und
physikochemischen Eigenschaften der Wandmaterialien. Die Auswahl des
angewendeten Verfahrens ist abhängig von den chemischen und physikalischen
Eigenschaften des Kern- und Kapselmaterials, dem Freisetzungsmechanismus des
Inhaltes, der bevorzugten Partikelgröße, den bestehenden technischen sowie
technologischen Möglichkeiten und Anforderungen (KUNZ et al. 2003).
2.3.3.2 Verfahren
Grundsätzlich lassen sich die Verfahren der Mikroverkapselung einteilen in
physikalische (z. B. Sprühtrocknung, Gefriertrocknung, Wirbelschicht-Coating,
Extrusion und Co-Kristallisation), chemische (z. B. Grenzflächenpolymerisation,
molekularer Einschluss) und physikochemische Verfahren (z. B. Koazervation,
liposomaler Einschluss) (KUNZ et al. 2003).
Nach THIES (2001) existieren viele verschiedene Verkapselungstechniken und auch
bei der Art der Klassifizierung gibt es unterschiedliche Möglichkeiten. THIES (2001)
unterteilt die Verkapselungstechniken in sog. Typ A und Typ B Prozesse. Hierbei
können die Typ A Prozesse, die eigentlich chemische Prozesse darstellen, auch auf

Wissenschaftliches Schrifttum
physikalische Phänomene angewiesen sein, und die mechanischen Typ B Prozesse
entsprechend chemische Reaktionen beinhalten.
VILSTRUP (2001) unterschied zwischen der einfachen Kernverkapselung und
andererseits der multiplen Kernverkapselung.
Im Vergleich zur begrenzten Zahl chemischer bzw. physikochemischer Methoden
existieren zahlreiche physikalische Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln. Bei
den physikalischen Verfahren wird das Kernmaterial (Core) mit Hilfe mechanischer
Mittel entweder mit dem Kapselmaterial ummantelt (Coating) oder in eine Matrix
eingebettet. Zur Verkapselung von Lebensmittelinhaltsstoffen werden hauptsächlich
die Sprühtrocknung, Gefriertrocknung, Extrusion und Wirbelschichttrocknung
angewendet (KUNZ et al. 2003).
Das Verkapselungsverfahren der Wahl für einen schonenden, relativ einfachen
kontinuierlichen Prozess in der Lebensmittelindustrie zur Verarbeitung und
Umhüllung hitzeempfindlicher Substanzen ist die Sprühtrocknung. Die zu
verkapselnden Materialien werden in einer Flüssigkeit, die das Kapselmaterial
enthält, dispergiert und über den Trocknungsprozess vom flüssigen Zustand in eine
trockene, partikuläre Form überführt. Der Verkapselungseffekt ist abhängig von den
molekularen und partikularen Wechselwirkungen an den sich bildenden
Phasengrenzflächen. Das Verfahren ist trotz der hohen Trocknungstemperaturen
auch für hitzeempfindliche Substanzen geeignet, da die Verweilzeit sehr kurz ist und
die Kerntemperaturen somit wenig beeinflusst werden (KUNZ et al. 2003).
Bei der Gefriertrocknung wird das Kernmaterial in eine wässrige Lösung des
Kapselmaterials gebracht. Die konventionelle Gefriertrocknung ist dadurch
gekennzeichnet, dass der Kapselmateriallösung das Wasser entzogen wird, und das
Kernmaterial dadurch verkapselt. Charakteristisch ist dabei die Überführung des
gefrorenen Wassers unter Umgehung des flüssigen in den gasförmigen
Aggregatzustand. Es findet also eine Sublimation statt (KUNZ et al. 2003).
63

64
Wissenschaftliches Schrifttum
Die sog. Extrusion zählt zu den Formgebungsverfahren und ermöglicht die
Verkapselung von hoch viskösen Dispersionen bei relativ niedrigen Temperaturen.
Bei der Zentrifugal-Extrusion werden das Kapsel- und Kernmaterial unter hohem
Druck durch eine rotierende Doppeldüse gepresst. An der Austrittsstelle wird das
Kernmaterial mit dem noch flüssigen Kapselmaterial umhüllt. Die Zentrifugalkraft der
rotierenden Düse treibt den Austrittsstrahl nach außen und verursacht das
Abbrechen in Form winziger Partikel. Aufgrund der Oberflächenspannung umhüllt
das Kapselmaterial die Kernsubstanz und die Kapselbildung erfolgt (KUNZ et al.
2003).
Das Wirbelschicht-Coating (Fließbett-Beschichtung) schließt fluidisierende Partikel
durch Besprühen mit Kapselmaterial in der Wirbelschicht ein. Die Luftströmung kann
entweder im Gleich- oder Gegenstrom erfolgen und ermöglicht eine gleichmäßige
Umhüllung der zu verkapselnden Partikel mit dem Wandmaterial. Es erfolgt eine
Suspension der Kernmaterialien in heißer oder kalter Wirbelschicht. Durch Ventile
wird das geschmolzene bzw. in einem leicht flüchtigen Lösungsmittel gelöste
Wandmaterial über die Wirbelschicht in die Kammer gesprüht. Gleichzeitig werden
die umhüllten Partikel durch die Wirbelschicht in Suspension gehalten, wodurch sich
ein gleichmäßiger, dünner Film auf der Oberfläche ausbilden kann. Erreichen die
Partikel das Ende des oberen Luftstromes, ist die äußere Umhüllung nahezu
getrocknet, und die Partikel werden erneut der Wirbelschicht zugeführt. Je nachdem
wie oft die Partikel diesen Zyklus durchlaufen, kann die Partikelgröße bestimmt
werden (KUNZ et al. 2003).
Kleine Tropfen und eine niedrige Viskosität des Sprühmediums sichern einen
gleichmäßigen Produktauftrag. Man unterscheidet, wie in Abbildung 2 dargestellt, je
nach Technologie, das Top-Spray-Coating, das Bottom-Spray-Coating (Wurster-
Coating) und das Tangential-Spray-Coating (Rotor-Pellet-Coating) (GLATT ® 2006).

a)
Wissenschaftliches Schrifttum
a) Top-Spray-Coating, b) Bottom-Spray-Coating, c) Tangential-Spray-Coating
Abbildung 2: Prinzipien Wirbelschicht-Coating (GLATT ® 2006)
b)
Beim sog. Top-Spray-Coating in der Wirbelschicht (Abb. 3) werden Partikel im Strom
der erwärmten Zuluft, die über eine Bodenplatte in den Produktbehälter eingetragen
wird, fluidisiert. Die Coatingflüssigkeit wird über eine Düse gegen den Luftstrom
(countercurrent) von oben herab in das Wirbelbett eingesprüht. Bei der weiteren
Aufwärtsbewegung der Teilchen im Luftstrom erfolgt die Trocknung. Kleine Tropfen
und eine niedrige Viskosität des Sprühmediums sichern eine gleichmäßige
Verteilung. Dieses Verfahren eignet sich für allgemeine Überzüge bis hin zum
Enteric-Coating (GLATT ® 2006).
Abbildung 3: Prinzip Wirbelschicht-Coating im kontinuierlichen Glatt ® -
Fließbett Top-Spray (GLATT ® 2006)
Das Bottom-Spray-Coating (Wurster-Coating) eignet sich besonders für eine
gesteuerte Wirkstofffreisetzung (controlled release). Im sog. Wurster-Prozess kann
ein vollständiger Verschluss der Oberfläche mit geringem Einsatz von Coating-
C)
65

66
Wissenschaftliches Schrifttum
Substanz erreicht werden. Die Sprührichtung der Coatingflüssigkeit ist mit der der
Zuluft gleichgerichtet (concurrent), wobei sich die Sprühdüse in der Bodenplatte
befindet. Durch den Einsatz eines Wurster-Zylinders und der Bodenplatte mit
unterschiedlicher Perforation werden die zu überziehenden Teilchen im Inneren des
Wurster-Rohres beschleunigt und im Gleichstrom durch den Sprühkegel geleitet. Bei
der weiteren Aufwärtsbewegung trocknen die Teilchen und fallen außerhalb des
Wusterrohres wieder in Richtung Bodenplatte zurück. Sie werden von der
Außenseite wieder zur Innenseite des Rohres geleitet, wo sie erneut durch den
Sprühstrahl beschleunigt werden. Es entstehen dadurch sehr homogene Filme und
unterschiedlich große Partikel können gleichmäßig befilmt werden (GLATT ® 2006).
Beim sog. Bottom-Spray-Coating im kontinuierlichen Fließbett (Abb. 4) wird das
Produkt auf der einen Seite der Verkapselungsanlage von unten kontinuierlich
zugegeben und durch den Luftstrom über den Siebboden weiter transportiert. Die
trockenen Teilchen werden kontinuierlich ausgetragen. Dieses Verfahren eignet sich
besonders für Schutzüberzüge/Farbüberzüge bei hoher Produktdurchsatzrate
(GLATT ® 2006).
Abbildung 4: Prinzip Wirbelschicht-Coating im kontinuierlichen Glatt ® -
Fließbett Bottom-Spray (GLATT ® 2006)
Für Überzüge mit hohem Feststoffanteil ist das Tangential-Spray-Coating (Rotor-
Pellet-Coating) optimal geeignet. Dabei wird das Produkt durch eine rotierende
Bodenplatte, an deren Rand die Zuluft ins Pulverbett geleitet wird, in eine helikale
Bewegung gebracht. Die Sprühdüse ist tangential zur Rotorscheibe angeordnet und

Wissenschaftliches Schrifttum
sprüht ebenfalls gleichgerichtet (concurrent) in das Pulverbett. Durch das Rotor-
Verfahren lassen sich sehr dicke Filmschichten auftragen (GLATT ® 2006).
2.3.3.3 Freisetzung des Kapselinhaltes
Die Freisetzung von verkapselten Substanzen wird beeinflusst durch physikalische
Kräfte (z. B. mechanische Zerstörung beim Kauvorgang), chemische und
enzymatische Abläufe, Auflösen des Wandmaterials, Schmelzen des Wandmaterials,
Erhitzen über die Siedetemperatur des Kernmaterials (Zerstörung durch Überdruck),
Diffusion des Kernmaterials (bei permeablen Kapseln) und Diffusion der
umgebenden Substanzen in die Kapsel (Konzentrationsgradient; Zerstörung durch
Überdruck bei semipermeablen Kapseln) (HOBEIN u. LUTZ 1989). Außerdem
beeinflussen osmotische Verhältnisse, pH-Wert-Änderungen sowie
Druckveränderungen die Freisetzung eingeschlossener Komponenten. Ebenfalls zu
beachten ist, dass auch Rissbildungen an Grenzflächen (z. B. durch Trocknung) die
Freisetzung der Substanzen verändern können (MUSCHIOLIK u. NAUMANN 2002).
2.3.3.4 Ziele
MUSCHIOLIK u. NAUMANN (2002) fassen die Effekte, die mit einer Verkapselung
oder einem Matrixeinschluss verfolgt werden, wie folgt zusammen. Es sollen
stoffliche Veränderungen bei den eingeschlossenen Komponenten vermieden
(Schutz vor Licht, Luft, Feuchtigkeit, pH-Änderung) und so die gewünschte
biologische Wirkung gesichert und die Haltbarkeit verlängert werden. Des Weiteren
soll die Abnahme der Bioverfügbarkeit der Komponenten während der
Lebensmittelherstellung (z. B. Oxidation oder Ligandenbildung der Mineralstoffe)
vermieden werden. Weiterhin ist es das Ziel, den Stofftransport in die äußere
Umgebung zu vermeiden (in Lebensmittelemulsionen z. B. aus der dispersen in die
67

68
Wissenschaftliches Schrifttum
kontinuierliche Phase). Auch eine leichtere Handhabbarkeit in der
Lebensmittelherstellung (Einbringen in eine Matrix zur besseren Dosierbarkeit oder
Mischbarkeit, geringere Stauberzeugung durch Partikelvergrößerung z. B. durch
Aggregation kleiner Partikel auf > 150 µm usw.) soll sichergestellt werden. Wichtig ist
auch die Möglichkeit, durch die Verkapselung eine negative sensorische
Veränderung des Lebensmittels durch bioaktive Zusätze zu verhindern, wie z. B.
eine Maskierung des Eigengeschmacks oder -geruchs (z. B. Fischöl, Vitamine,
Pflanzenextrakte) oder Vermeidung der Reaktion mit anderen
Lebensmittelbestandteilen (z. B. Kaffeesäure, Tannine mit Proteinen, Peptide mit
reduzierenden Zuckern, Enzymreaktionen). Speziell für probiotische Lebensmittel
erscheint es von Interesse, inwieweit der Einschluss der Mikroorganismen in eine
Matrix diese vor technologischen Einflüssen (z. B. Gefrierprozess) und nach dem
Verzehr während der Magenpassage schützt (MUSCHIOLIK u. NAUMANN 2002).
KUNZ et al. (2003) konnten zeigen, dass eine gezielte Kombination von
Kapselmaterialien zu einer hohen Stabilität probiotischer L. acidophilus-Kulturen
führt.
Nach DESMOND et al. (2002 a) überlebte der L. paracasei NFBC 338 Stamm,
betrachtet über einen Lagerungszeitraum von vier Wochen bei 4 - 30 °C, in
sprühgetrocknetem Pulver mit Gummi arabicum besser als ohne diesen Zusatz.
DESMOND et al. (2002 b) konnten außerdem zeigen, dass an Hitze und Salz
adaptierte L. paracasei NFBC 338 Stämme im Vergleich zur Kontrolle eine bessere
Lebensfähigkeit nach einer Sprühtrocknung aufwiesen.
L. rhamnosus in Alginat-Kapseln erwies sich in Untersuchungen von DEMBCZYNSKI
und JANKOWSKI (2002) während einer 60-stündigen Fermentation als stabil und
wurde nicht freigesetzt. Im Vergleich zu den nicht verkapselten Proben zeigten die
mit den Alginat-Kapseln höhere Konzentrationen, aber auch eine geringere
Produktivität.

Wissenschaftliches Schrifttum
GARDINER et al. (2000) untersuchten das Überleben von zwei Lactobacillus
Stämmen menschlicher Herkunft mit probiotischem Potential, L. paracasei NFBC 338
und L. salivarius UCC 118, während Hitzebehandlung und Sprühtrocknung. Der
L. paracasei-Stamm erwies sich als hitzestabiler und zeigte auch eine bessere
Überlebensfähigkeit während der Sprühtrocknung. Während der ersten zwei Monate
der Lagerung bei 4 °C blieb die Konzentration des verkapselten L. paracasei nahezu
konstant. Im Gegensatz dazu nahm die Konzentration bei dem zweiten Stamm,
L. salivarius, und identischen Lagerungsbedingungen um ca. eine log-Stufe ab.
Während der Lagerung stand das Überleben der beiden pulverförmigen Stämme in
umgekehrter Beziehung zur Lagerungstemperatur.
69

70
Wissenschaftliches Schrifttum
2.4 Zusammenfassende Auswertung des wissenschaftlichen
Schrifttums
Die zusammenfassende Auswertung des wissenschaftlichen Schrifttums ergab, dass
bisher keine Studien mit mikroverkapselten probiotischen Bakterien durchgeführt
wurden, in denen diese zusammen mit Kochsalz und Gewürzen gelagert wurden und
hinsichtlich ihrer Stabilität bei verschiedenen Temperaturen über die Zeit überprüft
wurden.
Probiotika und deren Einsatz bei der Herstellung von Milcherzeugnissen sind gut
erforscht, bei Fleischerzeugnissen gibt es hingegen bisher nur Versuche mit
Starterkulturen. Neue Verkapselungstechnologien könnten den Einsatz in
Fleischerzeugnissen ermöglichen.
Es wurde bereits die Stabilität von mikroverkapselten probiotischen Bakterien
untersucht, ebenso das Überleben von probiotischen Bakterien in
Fleischerzeugnissen
Starterkulturen.
und die antimikrobielle Wirkung von Gewürzen auf
In der vorliegenden Arbeit sollen verschiedene Einflüsse, u. a. die antimikrobielle
Wirkung von Gewürzen, auf mikroverkapselte probiotische Bakterien in einem
Lagerungsversuch untersucht werden, mit dem Ziel diese zukünftig auch in
Fleischerzeugnissen einsetzen zu können.

3 Eigene Untersuchungen
3.1 Material
3.1.1 Verwendete Bakterien
Eigene Untersuchungen
Bei den verwendeten Bakterienstämmen handelte es sich um Re-Isolate aus
verschiedenen probiotischen Produkten.
Im Einzelnen handelte es sich um folgende in Tabelle 12 aufgeführte
Bakterienstämme.
Tabelle 12: Verwendete Bakterienstämme
Eigene
Bezeichnung
Genus Spezies Bezugsquelle Herkunft
S 24 Lactobacillus reuteri Wien 1 Probiotisches
Milcherzeugnis
S 25 Lactobacillus rhamnosus Wien 1 Probiotisches
Milcherzeugnis
S 26 Lactobacillus paracasei Eigenisolat 2
Probiotisches
Milcherzeugnis
S 28 Lactobacillus gasseri Eigenisolat 2 Probiotikum,
Humanmedizin
1
Universität für Bodenkultur Wien, Department für Lebensmittelwissenschaften und -technologie,
Abteilung Lebensmittelmikrobiologie und -hygiene
2
Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
71

3.1.1.1 Lyophilisate
72
Eigene Untersuchungen
Die Lyophilisation der Stämme S 24, S 25, S 26 und S 28 erfolgte durch die Firma
THT SA, Gembloux, Belgien. Die Zusammensetzung der Lyophilisate ist der
Tabelle 13 zu entnehmen.
Tabelle 13: Zusammensetzung Lyophilisate, THT SA 1
Gefriergetrocknetes Ferment 10 %
Maltodextrin 90 %
1 THT SA, Gembloux, Belgien
3.1.1.2 Mikroverkapselte Bakterien
Die Mikroverkapselung der von THT SA gelieferten lyophilisierten Stämme S 24,
S 25, S 26 und S 28 erfolgte durch die Firma Micap ® GmbH, Bremerhaven,
Deutschland. Die Verkapselung erfolgte sowohl mit einem wasserlöslichen als auch
mit einem wasserunlöslichen Coating.
Rohstoffe für wasserlösliches Coating:
• Maltodextrin
• Native Maisstärke
Rohstoffe für wasserunlösliches Coating:
• Gehärtetes, raffiniertes Pflanzenfett auf der Basis von laurinfreien Fetten
• Zuckerester
• Methylcellulose
Die genaue Musterübersicht der mikroverkapselten Bakterien ist in der Tabelle 14
aufgeführt.

Eigene Untersuchungen
Tabelle 14: Musterübersicht der mikroverkapselten Bakterien, Micap ® GmbH 1
Micap ® -Muster-Nr. Micap ® -Beschreibung
015.005 S 24 – 10 % Maltodextrincoating
015.006 S 24 – 30 % Maltodextrincoating
015.007 S 24 – 50 % Maltodextrincoating
015.008 S 25 – 10 % Maltodextrincoating
015.009 S 25 – 30 % Maltodextrincoating
015.010 S 25 – 50 % Maltodextrincoating
015.011 S 26 – 10 % Maltodextrincoating
015.012 S 26 – 30 % Maltodextrincoating
015.013 S 26 – 50 % Maltodextrincoating
015.014 S 28 – 10 % Maltodextrincoating
015.015 S 28 – 30 % Maltodextrincoating
015.016 S 28 – 50 % Maltodextrincoating
015.017 S 24 – 10 % Fettcoating
015.018 S 24 – 30 % Fettcoating
015.019 S 24 – 50 % Fettcoating
015.020 S 25 – 10 % Fettcoating
015.021 S 25 – 30 % Fettcoating
015.022 S 25 – 50 % Fettcoating
015.023 S 26 – 10 % Fettcoating
015.024 S 26 – 30 % Fettcoating
015.025 S 26 – 50 % Fettcoating
015.026 S 28 – 10 % Fettcoating
015.027 S 28 – 30 % Fettcoating
015.028 S 28 – 50 % Fettcoating
1 Micap ® GmbH, Bremerhaven, Deutschland
S 24: L. reuteri, S 25: L. rhamnosus, S 26: L. paracasei, S 28: L. gasseri
73

3.1.2 Nährmedien
74
Eigene Untersuchungen
In der Tabelle 15 sind die verwendeten Nährmedien für die Kultivierung der
Laktobazillen sowie für die Untersuchung der Gewürze aufgeführt. Weitere
Informationen zu den Nährmedien und auch über die technischen Geräte und
Verbrauchsmaterialien sind im Anhang (Kap. 10.2 und 10.3) zu finden.
Tabelle 15: Nährmedienübersicht
Nährmedium Artikel-Nr.,
Hersteller
Agar-Nr. 1, neutral
LP 11, Oxoid,
(Bakteriologischer Agar) Wesel,
Deutschland
CASO-Agar
(Caseinpepton-Sojamehlpepton-
Agar)
MRS-Bouillon
(Lactobacillus-Bouillon nach de
Man, Rogosa und Sharp)
MRS-Nährboden
(Lactobacillus-Agar nach de Man,
Rogosa und Sharpe)
105458, Merck,
Darmstadt,
Deutschland
CM 359, Oxoid,
Wesel,
Deutschland
CM 361, Oxoid,
Wesel,
Deutschland
RAMBACH ® -Agar 107500, Merck,
Darmstadt,
Deutschland
Untersuchungsparameter
Milchsäurebakterien/
Laktobazillen
Aerobe Sporenbildner
Milchsäurebakterien/
Laktobazillen
Milchsäurebakterien/
Laktobazillen
Salmonellen

Salmonella-
Eigene Untersuchungen
Nährmedium Artikel-Nr.,
Anreicherungsbouillon nach
RAPPAPORT zur selektiven
Anreicherung von Salmonella
Standard I-Nähragar
TBG-Bouillon, modifiziert
(Tetrathionat-Brilliantgrün-Galle-
Anreicherungsbouillon)
TSC-Agar
(Tryptose-Sulfit-Cycloserin-Agar)
VRBD-Agar
(Kristallviolett-Neutralrot-Galle-
Glucose-Agar nach MOSSEL)
XLD-Agar
YGC-Agar
(Hefeextrakt-Glucose-
Chloramphenicol-Agar FIL-IDF)
Hersteller
110236, Merck,
Darmstadt,
Deutschland
107881, Merck,
Darmstadt,
Deutschland
105178, Merck,
Darmstadt,
Deutschland
111972, Merck,
Darmstadt,
Deutschland
110275, Merck,
Darmstadt,
Deutschland
105287, Merck,
Darmstadt,
Deutschland
116000, Merck,
Darmstadt,
Deutschland
Untersuchungs-
parameter
Salmonellen
Aerobe
Gesamtkeimzahl
Salmonellen
Mesophile
sulfitreduzierende
Clostridien
Enterobacteriazeen
Salmonellen
Hefen und
Schimmelpilze
75

76
Eigene Untersuchungen
Für die eigenen Untersuchungen wurde ein modifizierter MRS-Nährboden
eingesetzt. Für Herstellung des modifizierten MRS-Nährbodens wurden 62 g MRS-
Nährboden und 5 g Agar-Nr. 1, neutral (Bakteriologischer Agar) in 1 l Aqua dest.
suspendiert, bis zum vollständigen Lösen erhitzt und anschließend bei 121 °C für
15 Minuten autoklaviert. Im Folgenden wird dieser modifizierte MRS-Nährboden nur
noch als MRS-Nährboden bezeichnet.
3.1.2.1 Lösungen
Die folgenden Lösungen wurden als Verdünnungslösung bzw. zur Voranreicherung
verwendet.
NaCl-Pepton-Lösung
8,5 g Natriumchlorid (106400, Merck, Darmstadt, Deutschland) und 1 g Pepton aus
Casein, „granuliert“, pankreatisch verdaut (107213, Merck, Darmstadt, Deutschland)
in 1 l Aqua dest. lösen und in Reagenzgläser à 9 ml abfüllen, 15 Minuten bei 121 °C
autoklavieren.
Peptonwasser (gepuffert) nach ISO 6579
107228, Merck, Darmstadt, Deutschland
25,5 g in 1 l Aqua dest. lösen. 15 Minuten bei 121 °C autoklavieren. pH 7,0 ± 0,2 bei
25 °C.
3.1.3 Lagerungsmaterial
Als Lagerungsmaterialien wurden Gelatine und verschiedene Zusätze verwendet.

3.1.3.1 Gelatine
Eigene Untersuchungen
Als Lagerungsmedium für die mikroverkapselten Stämme wurde GELITA ®
Speisegelatine, 240 Bloom 20 mesh PS (Artikel-Nr.: 111 240 030 01,
LOT-Nr.: 621 138, Produktionsdatum 29.08.2005) der GELITA ® AG, Eberbach,
Deutschland, verwendet.
3.1.3.2 Zusätze
Als Zusätze zum Lagerungsmedium wurden einerseits Kochsalz und andererseits
verschiedene Gewürze verwendet.
Als Kochsalz wurde NaCl für die Bakteriologie, LP 05, Oxoid, Wesel, Deutschland
verwendet.
Die verschiedenen Gewürze wurden von der Hannoverschen Gewürzmühle,
Hannover, Deutschland, bezogen. Eine Übersicht über die verschiedenen Gewürze
gibt die Tabelle 16.
77

78
Eigene Untersuchungen
Tabelle 16: Übersicht über die verwendeten Gewürze und deren Einsatz
Gewürz Verwendung
Nelken, gemahlen Vorversuch, Lagerungsversuch
Schwarzer Pfeffer, gemahlen Vorversuch, Lagerungsversuch
Knoblauchgranulat Vorversuch
Oregano, gerebelt Vorversuch
Ingwer, gemahlen Vorversuch
Senfkörner Vorversuch
Basilikum, gerebelt Vorversuch
Rosen-Paprika, gemahlen Vorversuch
Paprika edelsüß, gemahlen Vorversuch
Majoran, gemahlen Vorversuch
Zwiebelgranulat Vorversuch
Kümmel, gemahlen Vorversuch
3.2 Methoden
3.2.1 Isolierung, Kultivierung und Sicherung der Stämme
Die Kultivierung der Laktobazillen erfolgte in Anlehnung an die in der Amtlichen
Sammlung von Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB
vorgeschriebene Methode (L 06.00-35).
Die anaerobe Bebrütungsatmosphäre wurde entweder im Anaerobiertopf mit
AnaeroGen (Oxoid) oder im CO2-Brutschrank (Binder) erzeugt. Die Atmosphäre im
Brutschrank wurde analog zu der Atmosphäre im Anaerobiertopf mit AnaeroGen TM
(Oxoid) auf 0,9 % O2, 10 % CO2 und 89,1 % N2 eingestellt. Die
Bebrütungstemperatur betrug 37 °C ± 0,5 °C.

Eigene Untersuchungen
3.2.1.1 L. reuteri (S 24) und L. rhamnosus (S 25)
Bei S 24, Lactobacillus reuteri, und S 25, Lactobacillus rhamnosus, handelte es sich
um Produkt-Re-Isolate, isoliert aus probiotischen Milcherzeugnissen durch die
Universität für Bodenkultur Wien, Department für Lebensmittelwissenschaften und
-technologie, Abteilung Lebensmittelmikrobiologie und -hygiene, geliefert als
Kryokulturen.
Jeweils 200 µl verflüssigte Kryokultur wurden in 10 ml MRS-Bouillon (BI) überführt.
Die Bebrütung erfolgte im Anaerobiertopf für 24 h ± 2 h. Nach 24 h ± 2 h erfolgte eine
Überimpfung von 200 µl aus BI in 10 ml neue MRS-Bouillon (BII) und eine weitere
Bebrütung für 24 h ± 2 h. Nach 24 h ± 2 h wurden fraktionierte Ausstriche auf MRS-
Agarplatten (AI) im Doppelansatz durchgeführt und diese für 48 h ± 2 h bebrütet.
Nach 48 h ± 2 h wurden die Ansätze makroskopisch und nach Gramfärbung auch
mikroskopisch kontrolliert und jeweils eine Kolonie in neue MRS-Bouillon (BIII)
überimpft. Diese Bouillon (BIII) wurde 24 h ± 2 h bebrütet. Nach 24 h ± 2 h wurde die
Bouillon im Doppelansatz auf MRS-Agarplatten (AII) fraktioniert ausgestrichen und
für 48 h ± 2 h bebrütet. Nach 48 h ± 2 h wurden die Ansätze makroskopisch und
mikroskopisch kontrolliert. Die Stämme S 24 und S 25 wurden anschließend als
Reinkulturen in das Microbank-System nach Anweisung des Herstellers überführt.
Der Schraubverschluss des Microbank-Röhrchens wurde unter sterilen
Bedingungen geöffnet. Der im Röhrchen enthaltene Kryopuffer wurde mit Kolonien
aus der Reinkultur inokuliert. Das Inokulum sollte nach Microbank einem
McFarland Standard von 3 - 4 entsprechen. Anschließend wurde das Kryoröhrchen
fest verschlossen und 4- bis 5-mal durch Umdrehen gemischt. Durch den
Mischvorgang wurden die Organismen an die porösen Perlen gebunden. Der
überschüssige Kryopuffer wurde anschließend weitgehend abpipettiert, so dass die
Perlen weitgehend frei von Flüssigkeit waren. Anschließend wurde das Röhrchen
fest verschlossen und bei -80 °C ± 0,5 °C gelagert. Es wurden jeweils zwei solcher
Microbank-Röhrchen angefertigt.
79

80
Eigene Untersuchungen
Die nachfolgende Abbildung 5 gibt eine schematische Übersicht über die Isolierung
und Kultivierung von Lactobacillus reuteri (S 24) und Lactobacillus rhamnosus (S 25).
Abbildung 5: L. reuteri (S 24) und L. rhamnosus (S 25): Isolierung,
3.2.1.2 L. paracasei (S 26)
200 µl Kryokultur S 24 bzw. S 25
MRS-Bouillon (BI)
MRS-Bouillon (BII)
MRS-Agarplatte (AI)
MRS-Bouillon (BIII)
MRS-Agarplatte (AII)
Microbank
Kultivierung und Sicherung der Stämme
S 26, Lactobacillus paracasei, wurde aus einem probiotischen Milcherzeugnis
isoliert. Dabei handelte es sich um ein fermentiertes Getränk aus Magermilch mit
dem Stamm Lactobacillus casei Shirota und laut Herstellerangaben folgenden

Eigene Untersuchungen
Zutaten: Wasser, Magermilch, Glukosesirup, Zucker, Aroma, Lactobacillus casei
Shirota.
Für die Isolierung des Stammes S 26, Lactobacillus paracasei, wurde eine dezimale
Verdünnungsreihe angelegt. Dazu wurden 90 ml NaCl-Pepton-Lösung mit 10 ml des
probiotischen Milcherzeugnisses versetzt und homogenisiert. 1 ml aus diesem
Ansatz entsprach einer Verdünnung von 10 -1 . 0,1 ml aus diesem Ansatz entsprachen
einer Verdünnung von 10 -2 . Für die Herstellung der nächsthöheren
Verdünnungsstufe wurde jeweils 1 ml der niedrigeren Verdünnungsstufe mit 9 ml
NaCl-Pepton-Lösung versetzt und homogenisiert, usw. Es erfolgte eine Verdünnung
bis 10 -7 . Jeweils 0,1 ml der sechs Verdünnungsstufen 10 -2 bis 10 -7 wurden im
Doppelansatz auf eine MRS-Agarplatte (AI) pipettiert und ausgespatelt. Die
Bebrütung erfolgte im Anaerobiertopf für 48 h ± 2 h. Nach 48 h ± 2 h wurden die
Agarplatten makroskopisch und mikroskopisch hinsichtlich des Wachstums
kontrolliert. Jeweils eine Kolonie wurde in 10 ml MRS-Bouillon (BI) überimpft und für
24 h ± 2 h bebrütet. Nach 24 h ± 2 h wurden fraktionierte Ausstriche im Doppelansatz
auf MRS-Agarplatten (AII) angefertigt und für 48 h ± 2 h bebrütet. Eine Kontrolle des
Wachstums erfolgte nach 48 h ± 2 h makroskopisch sowie mikroskopisch. Die
Reinkultur des Stammes wurde in das Microbank-System, wie oben für S 24 und
S 25 beschrieben, überführt. Es wurden jeweils zwei Microbank-Röhrchen
angefertigt und diese dann bei -80 °C ± 0,5 °C gelagert.
Die Abbildung 6 zeigt schematisch die Isolierung und Kultivierung von Lactobacillus
paracasei (S 26).
81

82
Eigene Untersuchungen
Abbildung 6: L. paracasei (S 26): Isolierung, Kultivierung und Sicherung
3.2.1.3 L. gasseri (S 28)
des Stammes
Probiotisches Milcherzeugnis
Verdünnungsreihe
MRS-Agarplatte (AI)
MRS-Bouillon (BI)
MRS-Agarplatte (AII)
Microbank
S 28, Lactobacillus gasseri, wurde aus einem humanmedizinischen Probiotikum
isoliert. Dabei handelte es sich um ein traditionelles Arzneimittel und
darmspezifisches Probiotikum aus lebensfähigen Milchsäurebakterien. Folgende
arzneilich wirksame Bestandteile waren laut Beipackzettel pro Hartkapsel enthalten:
25 mg Lyophilisat aus Lactobacillus gasseri entsprechend 8 x 10 9 KbE/g mit Rest-
Kulturmedium, sowie 25 mg Lyophilisat aus Bifidobacterium longum entsprechend
8 x 10 9 KbE/g mit Rest-Kulturmedium. Die sonstigen Bestandteile waren Gelatine,
Laktose, gefälltes Siliciumdioxid, Natriumdodecylsulfat. Ausgangsstoffe der Rest-

Eigene Untersuchungen
Kulturmedien sind: H-Vollmilch, Pepton, Natriumhydroxid, Natriumcarbonat,
Calciumcarbonat, Ascorbinsäure, Lactose-Monohydrat, Sucrose (Saccharose) und
Gelatine.
Für die Isolierung des Stammes wurde der Inhalt einer Hartkapsel in 10 ml MRS-
Bouillon (BI) überführt und homogenisiert. Die Inkubation erfolgte im Anaerobiertopf
für 24 h. Nach 24 h ± 2 h wurden 200 µl aus BI in eine neue MRS-Bouillon (BII)
überführt und für 24 h ± 2 h bebrütet. Nach 24 h ± 2 h wurden fraktionierte Ausstriche
auf MRS-Agarplatten (AI) im Doppelansatz durchgeführt und dann 48 h ± 2 h
inkubiert. Nach 48 h ± 2 h wurde das Wachstum makroskopisch und mikroskopisch
kontrolliert und jeweils eine Kolonie in neue MRS-Bouillon (BIII) überimpft.
Anschließend wurde erneut für 24 h ± 2 h inkubiert. Nach 24 h ± 2 h erfolgte
fraktioniertes Ausstreichen im Doppelansatz auf MRS-Agarplatten mit nachfolgender
Inkubation der Platten für 48 h ± 2 h. Nach Ablauf der Inkubationszeit von 48 h ± 2 h
wurde das Wachstum makroskopisch und mikroskopisch kontrolliert und
anschließend der Stamm in das Microbank-System, wie oben für S 24 und S 25
beschrieben überführt. Es wurden zwei Microbank-Röhrchen der Reinkultur
angefertigt und diese bei -80 °C ± 0,5 °C gelagert.
Schematisch dargestellt ist die Isolierung und Kultivierung von Lactobacillus gasseri
(S 28) in der Abbildung 7.
83

84
Eigene Untersuchungen
Abbildung 7: L. gasseri (S 28): Isolierung, Kultivierung und Sicherung des
3.2.2 Vorversuche
Humanmedizinisches Probiotikum
Stammes
MRS-Bouillon (BI)
MRS-Bouillon (BII)
MRS-Agarplatte (AI)
MRS-Bouillon (BIII)
MRS-Agarplatte (AII)
Microbank
Im Rahmen der Vorversuche wurden die Bedingungen für den Lagerungsversuch
ermittelt. Untersucht wurde der Einfluss von zwölf verschiedenen Gewürzen sowie
von Kochsalz in drei verschiedenen Konzentrationen auf das Wachstum der vier
Bakterienstämme. Die Vorversuche wurden in zwei Untersuchungsgängen
durchgeführt: Gewürze 1 - 6 und Kochsalzkonzentrationen 1 %, 2 % und 5 %, sowie
Gewürze 7 - 12.

3.2.2.1 Einfluss Gewürze
Eigene Untersuchungen
Der Einfluss der unter 3.1.3.2 genannten Gewürze (Tab. 16), Nelken (gemahlen),
Schwarzer Pfeffer (gemahlen), Knoblauchgranulat, Oregano (gerebelt), Ingwer
(gemahlen), Senfkörner, Basilikum (gerebelt), Rosen-Paprika (gemahlen), Paprika
edelsüß (gemahlen), Majoran (gemahlen), Zwiebelgranulat und Kümmel (gemahlen),
auf die vier Bakterienstämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei
(S 26) und L. gasseri (S 28) wurde im ersten Teil der Vorversuche untersucht.
Zunächst wurden die im Microbank-System konservierten Stämme wieder
angezüchtet. Dazu wurde jeweils eine poröse Perle aus dem Microbank-Röhrchen
der Stämme S 24, S 25, S 26 und S 28 in jeweils 10 ml MRS-Bouillon (BI) gegeben
und für 24 h ± 2 h Stunden bei 37 °C ± 0,5 °C im Anaerobiertopf inkubiert. Nach
24 h ± 2 h erfolgte eine Überimpfung von jeweils 10 µl aus BI in jeweils 10 ml neue
MRS-Bouillon (BII) und anschließend wurde für 24 h ± 2 h inkubiert. Nach 24 h ± 2 h
wurden fraktionierte Ausstriche auf MRS-Agarplatten angefertigt und die Platten für
48 h ± 2 h bebrütet. Nach der genannten Inkubationszeit wurde jeweils eine Kolonie
in 10 ml neue MRS-Bouillon, die sogenannte Arbeitsbouillon (B1), überimpft und
24 h ± 2 h inkubiert.
Von dieser Arbeitsbouillon B1 wurde die Keimzahl in 200 µl nach einer Inkubation
von 24 h ± 2 h bestimmt. Dazu wurde eine dezimale Verdünnungsreihe angelegt. Für
die Verdünnungsstufe 10 -1 wurde 1 ml aus B1 zu 9 ml NaCl-Pepton-Lösung gegeben
und homogenisiert. 1 ml aus dieser 10 -1 -Verdünnung wurde zu 9 ml NaCl-Pepton-
Lösung gegeben und homogenisiert, um die Verdünnungsstufe 10 -2 zu erreichen. Auf
diese Weise wurde fortgefahren bis zu einer Verdünnungsstufe von 10 -8 . Untersucht
wurde jeweils im Doppelansatz mittels Spatelverfahren (100 µl pro Platte), sowie
mittels Tropfplattenverfahren (50 µl pro Sektor, vier Sektoren pro Platte) auf MRS-
Agarplatten (AI). Die Inkubation erfolgte für 48 h ± 2 h bei 37 °C ± 0,5 °C im CO2-
Brutschrank. Nach der Inkubation erfolgte eine makroskopische sowie
mikroskopische Kontrolle der Kolonien.
85

86
Eigene Untersuchungen
Bei der Auswertung des Spatelverfahrens wurden die zwei Verdünnungsstufen
berücksichtigt, bei denen auf den Platten 1 bis 150 gut abgesetzte Kolonien (ggf.
auch mehr, wenn gut auswertbar) auszählbar waren. Dabei sollte die niedrigere
Verdünnungsstufe mindestens 15 Kolonien aufweisen.
Bei der Auswertung des Tropfplattenverfahrens wurden die Verdünnungsstufen
berücksichtigt, bei denen innerhalb der Sektoren auf den Platten zwischen 1 und 50
klar voneinander abgesetzte Kolonien (ggf. auch mehr, wenn gut auswertbar)
auszählbar waren. Die niedrigere Verdünnungsstufe sollte mindestens 5 Kolonien
aufweisen.
Aus den Koloniezahlen der niedrigsten und der nächsthöheren auswertbaren
Verdünnungsstufe wurde der gewichtete Mittelwert mit der nachfolgenden Formel
berechnet.
∑ c
c =
n ⋅1+
n ⋅0,
1
1
2
c gewichteter Mittelwert der Koloniezahlen
∑c Summe der Koloniezahlen aller Platten beider Verdünnungsstufen, die
zur Berechnung herangezogen werden (niedrigste und nächsthöhere
auswertbare Verdünnungsstufe)
n 1 Anzahl der Platten der niedrigsten auswertbaren Verdünnungsstufe
n 2 Anzahl der Platten der nächsthöheren Verdünnungsstufe
Anschließend wurde c mit 10 multipliziert, um die Verdünnung von 1 : 10
(100 µl/Platte) beim Spatelverfahren bzw. mit 20 multipliziert, um die Verdünnung
von 1 : 20 (50 µl/Sektor) beim Topfplattenverfahren zu berücksichtigen. Das Ergebnis

Eigene Untersuchungen
wurde mit dem Kehrwert der niedrigsten auswertbaren Verdünnungsstufe
(Verdünnungsfaktor) multipliziert, um die Keimzahl pro ml zu errechnen. Das
Ergebnis wurde als Zahl zwischen 1,0 und 9,9 multipliziert mit der entsprechenden
Zehnerpotenz angegeben.
Die Ergebnisse aus Spatel- und Tropfplattenverfahren wurden hinsichtlich ihrer
Vergleichbarkeit überprüft.
Im Folgenden wurden jeweils 10 ml MRS-Bouillon (B2) mit Zusatz von 1 g ± 0,1 g
(entspricht 10 % Gewürzzusatz) der oben genannten Gewürze (GX), sowie als
Kontrolle auch 10 ml MRS-Bouillon (B2) ohne Zusätze mit 200 µl aus B1 beimpft.
Parallel dazu wurden als Negativkontrollen jeweils 10 ml MRS-Bouillon (B0) nur mit
Zusatz von 1 g ± 0,1 g der genannten Gewürze angesetzt. Inkubiert wurde anaerob
für 24 h ± 2 h. Nach 24 h ± 2 h wurde von jedem Ansatz eine mikroskopische
Kontrolle durchgeführt und eine dezimale Verdünnungsreihe bis 10 -8 wie oben
beschrieben angelegt. Es folgte eine Untersuchung im Doppelansatz mittels
Tropfplattenverfahren wie oben beschrieben. Die anaerobe Inkubation erfolgte für
48 h ± 2 h. Nach 48 h ± 2 h erfolgte makroskopisch und mikroskopisch die
Auswertung der Platten und Berechnung des gewichteten Mittelwertes und der
Keimzahl pro ml wie oben beschrieben.
Nun erfolgte ein Vergleich der Keimzahlen von B2 mit Zusätzen mit den Keimzahlen
von B2 ohne Zusätze, um eine Beeinflussung der gestesteten Gewürze auf das
Bakterienwachstum ausmachen zu können. Die B0 wurden ebenfalls hinsichtlich
eines Wachstums untersucht, um festzustellen, ob ggf. in den Gewürzen vorhandene
Keime unter den genannten Bedingungen wachsen bzw. die Testkeime beeinflussen.
3.2.2.2 Einfluss Kochsalzkonzentration
Im zweiten Teil der Vorversuche wurde analog zum ersten Teil, in dem die
verschiedenen Gewürze getestet wurden, der Einfluss von Kochsalz in drei
87

88
Eigene Untersuchungen
unterschiedlichen Konzentrationen auf die Bakterienstämme S 24, S 25, S 26 und
S 28 untersucht.
Das Anlegen der Arbeitsbouillon (B1) erfolgte wie beim Testen der verschiedenen
Gewürze (siehe Kap. 3.2.2.1).
Für diesen Teil der Vorversuche wurden als B2 drei verschiedene MRS-Bouillons
zubereitet. Die MRS-Bouillon wurde nach Rezept gekocht, jedoch mit Zusatz von
1 %, 2 % bzw. 5 % NaCl. Die MRS-Bouillon wurde dann nach Zusatz der jeweiligen
Kochsalzmenge und Homogenisierung à 10 ml in Reagenzgläser abgefüllt und
anschließend autoklaviert.
Die Beimpfung der B2 bzw. B2SX und die anschließende Auswertung erfolgten
wiederum wie bei der Untersuchung der Gewürze.
Der folgenden Abbildung (Abb. 8) kann der Versuchsaufbau der Vorversuche
schematisch entnommen werden.

B2
B2G1
B2G2
B2G3
B2G4
B2G5
B2G6
B2G7
B2G8
B2G9
B2G10
B2G11
B2G12
Eigene Untersuchungen
MRS-Bouillon (BI)
MRS-Bouillon (BII)
MRS-Agarplatte (AI)
MRS-Bouillon = Arbeitsbouillon (B1)
B0
B0G1
B0G2
B0G3
B0G4
B0G5
B0G6
B0G7
B0G8
B0G9
B0G10
B0G11
B0G12
MRS-Agarplatte (AII)
B2 = MRS-Bouillon = Kontrolle, B0 = MRS-Bouillon = Negativkontrolle, B2(B0)GX = MRS-Bouillon
B2 (B0) mit Zusatz von Gewürz GX, G1 = Senfkörner, G2 = Paprika edelsüß, G3 = Nelken
(gemahlen), G4 = Schwarzer Pfeffer (gemahlen), G5 = Knoblauchgranulat, G6 = Ingwer (gemahlen),
G7 = Rosenpaprika; G8 = Majoran (gemahlen), G9 = Kümmel (gemahlen); G10 = Zwiebelgranulat,
G11 = Basilikum (gerebelt), G12 = Oregano (gerebelt), B2(B0)SX = MRS-Bouillon B2 (B0) mit Zusatz
von NaCl SX, S1 = 1 % NaCl-Zusatz, S2 = 2 % NaCl-Zusatz , S5 = 5 % NaCl-Zusatz
Abbildung 8: Versuchsaufbau Vorversuche
B2
B2S1
B2S2
B2S5
B0
B0S1
B0S2
B0S5
89

3.2.3 Lyophilisation
90
Eigene Untersuchungen
Die Stämme S 24, S 25, S 26 und S 28 wurden der Firma THT SA, Gembloux,
Belgien jeweils in einem Microbank-Röhrchen zur Lyophilisation geliefert. Die
Firma THT produzierte von S 24 2,5 kg, von S 25, S 26 und S 28 jeweils 4,0 kg
Lyophilisat (Zusammensetzung siehe Kap. 3.1.1.1, Tab. 13). Als Produktionsdatum
wurde der 20.01.2006 angegeben. Die Lyophilisate waren feine, weiße Pulver und
wurden durch THT SA mikrobiologisch analysiert, um deren Konformitätskriterien zu
überprüfen. Im Einzelnen wurden die in Tabelle 17 aufgeführten Parameter
analysiert.
Tabelle 17: Analysedaten der lyophilisierten Stämme, THT SA 1
Parameter Methode Norm
S 24, S 25, S 26 bzw. S 28 MRS-Agar, 37 °C/72 h min. 10 10 KbE/g
Coliforme Keime Petrifilm, 37 °C/24 h negativ in 1 g
Enterobacteriaceae Petrifilm 3 M, 37 °C/24 h < 10 1 KbE/g
Hefen und Schimmelpilze Petrifilm 3 M, 30 °C/48 h < 10 1 KbE/g
1 THT SA, Gembloux, Belgien
3.2.4 Mikroverkapselung
Die Mikroverkapselung der von THT SA gelieferten lyophilisierten Stämme erfolgte
durch die Firma Micap ® GmbH, Bremerhaven, Deutschland.
Die Mikroverkapselung wurde mittels der diskontinuierlichen Wirbelschichtanlage
GPCG/1.1 (Glatt ® ) durchgeführt (Abb. 9).

Eigene Untersuchungen
Abbildung 9: Darstellung einer Wirbelschichtanlage GPCG (GLATT ® )
Beim Coating in der Wirbelschicht wurde das Lyophilisat in einem temperierten
Luftstrom fluidisiert und in eine Wirbelschicht überführt. Die Temperatur der
Prozessluft betrug 55 - 60 °C. Die Produkttemperatur während des gesamten
Prozesses lag bei 34 - 37 °C. Die Coatingflüssigkeit (Zusammensetzung des
wasserlöslichen und des wasserunlöslichen Coatings siehe Kap. 3.1.1.2, Tab. 14)
wurde über eine Sprühdüse mit einer Sprührate von ca. 11 g/Min. gegen den
aufströmenden Luftstrom von oben herab auf die Lyophilisate im Wirbelbett
eingesprüht, hierbei wurde ein Sprühdruck von ca. 2 bar erreicht (Abb. 10). Durch die
zugeführte Prozessluft verdunstete die Flüssigkeit und trocknete die Filmschicht auf
den Partikeln. Die entstandene Filmschicht umhüllte die Lyophilisate und bildete den
erwünschten Verkapselungs- bzw. Coatingeffekt. Die Sprühflüssigkeit wurde bis zu
der gewünschten Konzentration an Kapselmaterial auf das Lyophilisat gesprüht.
Danach konnte die Probennahme erfolgen.
91

92
Eigene Untersuchungen
Abbildung 10: Prinzip Wirbelschicht-Coating im kontinuierlichen Glatt ® -
Fließbett Top-Spray (GLATT ® )
Jeder der Stämme S 24, S 25, S 26 und S 28 wurde wasserlöslich mit einem
Maltodextrincoating und wasserunlöslich mit einem Fettcoating verkapselt. Bei jedem
der beiden Coatingverfahren wurden drei unterschiedliche Formulierungen erstellt:
10 %, 30 % bzw. 50 % Kapselanteil. Die genaue Beschreibung der Muster ist in
Kapitel 3.1.1.2 (Tab. 14) aufgeführt. Die jeweils erstellten Muster wurden in PE-
Flachbeuteln verpackt und bei 7 - 10 °C gelagert.
3.2.5 Einlagerung der Proben und Lagerungsbedingungen
Für die Lagerung der mikroverkapselten Stämme S 24, S 25, S 26 und S 28 bei zwei
verschiedenen Temperaturen und unter dem Einfluss von Kochsalz und Gewürzen
wurden Probenröhrchen vorbereitet.
3.2.5.1 Befüllung der Probenröhrchen und Lagerungsbedingungen
Die Lyophilisate der vier Stämme wurden in den Lagerungsversuch mit einbezogen.
Dazu wurden 1 g ± 0,1 g der Lyophilisate in autoklavierte Röhrchen steril
eingewogen.

Eigene Untersuchungen
GELITA ® Speisegelatine, 240 Bloom 20 mesh PS wurde in einer Verdünnung 100 g
pro 900 ml Aqua. dest. angesetzt und gelöst. Je 10 ml wurden in die
Lagerungsröhrchen abgefüllt und bei 121 °C ± 0,5 °C für 15 Minuten autoklaviert
(Lagerungsmedium Nr. 1).
Nach Auswertung der Vorversuche (siehe Kap. 3.2.2) wurden für den
Lagerungsversuch als Zusätze 5 % NaCl, 10 % Nelken bzw. 10 % Schwarzer Pfeffer
ausgewählt.
Dafür wurde einem Ansatz der Gelatineverdünnung 5 % Kochsalz zugesetzt und
homogenisiert. Anschließend wurde die Lösung ebenfalls zu 10 ml in die
Lagerungsröhrchen abgefüllt und bei 121 °C ± 0,5 °C für 15 Minuten autoklaviert
(Lagerungsmedium Nr. 2).
In einem weiteren Ansatz wurden zu jeweils 10 ml der autoklavierten Gelatinelösung
1,00 g ± 0,1 g Nelken (gemahlen) steril in jedes Lagerungsröhrchen eingewogen und
mit der Gelatine homogenisiert (Lagerungsmedium Nr. 3).
Als Lagerungsmedium Nr. 4 wurde zu 10 ml Gelatineverdünnung 1,00 g ± 0,1 g
Schwarzer Pfeffer (gemahlen) unter sterilen Bedingungen eingewogen.
Damit ergaben sich vier Arten von Lagerungsmedien: 1. Gelatineverdünnung ohne
Zusätze, 2. Gelatineverdünnung mit 5 % Kochsalz, 3. Gelatineverdünnung mit 10 %
Nelken (gemahlen) und 4. Gelatineverdünnung mit 10 % Schwarzem Pfeffer
(gemahlen).
Jede der 24 verschiedenen von der Micap ® GmbH gelieferten Proben (siehe
Kap. 3.1.1.2, Tab. 14, Muster-Nr. 015.005 bis 015.028) wurde steril à 1,00 g ± 0,1 g
in die vier verschiedenen Lagerungsmedien eingewogen und dann mit dem Medium
homogenisiert. Hierzu wurde die Gelatinelösung im Wasserbad bei 30 °C ± 0,5 °C
gelöst. Es wurden jeweils mehrere Röhrchen hergestellt.
Die Probenröhrchen wurden bei zwei Temperaturen gelagert: gekühlt bei
2 °C ± 0,5 °C (Proben-Nr. 1 - 100), sowie bei einer Raumtemperatur von
20 °C ± 0,5 °C (Proben-Nr. 101 - 200). Hieraus ergab sich der nachfolgend unter
3.2.5.2 aufgeführte Probenschlüssel (Tab. 18).
93

3.2.5.2 Probenschlüssel
94
Eigene Untersuchungen
In der folgenden Tabelle 18 ist der Probenschlüssel mit den Probenbezeichnungen
für den Lagerungsversuch aufgeführt.
Tabelle 18: Probenschlüssel
Proben-
Nr.
Micap-
Muster-
Nr.
Micap-
Beschreibung
Lagerungs-
art
Lagerungs-
temperatur
1 101 015.005 S 24 -10 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
2 102 Maltodextrincoating + 5 % NaCl
3 103 + 10 % Nelken
4 104
+ 10 % Pfeffer
5 105 015.006 S 24 - 30 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
6 106 Maltodextrincoating + 5 % NaCl
7 107 + 10 % Nelken
8 108
+ 10 % Pfeffer
9 109 015.007 S 24 - 50 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
10 110 Maltodextrincoating + 5 % NaCl
11 111 + 10 % Nelken
12 112
+ 10 % Pfeffer
13 113 015.008 S 25 - 10 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
14 114 Maltodextrincoating + 5 % NaCl
15 115 + 10 % Nelken
16 116
+ 10 % Pfeffer
17 117 015.009 S 25 - 30 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
18 118 Maltodextrincoating + 5 % NaCl
19 119 + 10 % Nelken
20 120
+ 10 % Pfeffer
21 121 015.010 S 25 - 50 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
22 122 Maltodextrincoating + 5 % NaCl
23 123 + 10 % Nelken
24 124
+ 10 % Pfeffer
25 125 015.011 S 26 - 10 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
26 126 Maltodextrincoating + 5 % NaCl
27 127 + 10 % Nelken
28 128
+ 10 % Pfeffer
29 129 015.012 S 26 - 30 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
30 130 Maltodextrincoating + 5 % NaCl
31 131 + 10 % Nelken
32 132
+ 10 % Pfeffer

Proben-
Nr.
Micap-
Muster-
Nr.
Eigene Untersuchungen
Micap-
Beschreibung
Lagerungs-
art
Lagerungs-
temperatur
33 133 015.013 S 26 - 50 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
34 134 Maltodextrincoating + 5 % NaCl
35 135 + 10 % Nelken
36 136
+ 10 % Pfeffer
37 137 015.014 S 28 - 10 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
38 138 Maltodextrincoating + 5 % NaCl
39 139 + 10 % Nelken
40 140
+ 10 % Pfeffer
41 141 015.015 S 28 - 30 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
42 142 Maltodextrincoating + 5 % NaCl
43 143 + 10 % Nelken
44 144
+ 10 % Pfeffer
45 145 015.016 S 28 - 50 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
46 146 Maltodextrincoating + 5 % NaCl
47 147 + 10 % Nelken
48 148
+ 10 % Pfeffer
49 149 015.017 S 24 - 10 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
50 150 Fettcoating + 5 % NaCl
51 151 + 10 % Nelken
52 152
+ 10 % Pfeffer
53 153 015.018 S 24 - 30 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
54 154 Fettcoating + 5 % NaCl
55 155 + 10 % Nelken
56 156
+ 10 % Pfeffer
57 157 015.019 S 24 - 50 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
58 158 Fettcoating + 5 % NaCl
59 159 + 10 % Nelken
60 160
+ 10 % Pfeffer
61 161 015.020 S 25 - 10 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
62 162 Fettcoating + 5 % NaCl
63 163 + 10 % Nelken
64 164
+ 10 % Pfeffer
65 165 015.021 S 25 - 30 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
66 166 Fettcoating + 5 % NaCl
67 167 + 10 % Nelken
68 168
+ 10 % Pfeffer
69 169 015.022 S 25 - 50 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
70 170 Fettcoating + 5 % NaCl
71 171 + 10 % Nelken
72 172
+ 10 % Pfeffer
95

96
Proben-
Nr.
Micap-
Muster-
Nr.
Eigene Untersuchungen
Micap-
Beschreibung
Lagerungs-
art
Lagerungs-
temperatur
73 173 015.023 S 26 - 10 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
74 174 Fettcoating + 5 % NaCl
75 175 + 10 % Nelken
76 176
+ 10 % Pfeffer
77 177 015.024 S 26 - 30 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
78 178 Fettcoating + 5 % NaCl
79 179 + 10 % Nelken
80 180
+ 10 % Pfeffer
81 181 015.025 S 26 - 50 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
82 182 Fettcoating + 5 % NaCl
83 183 + 10 % Nelken
84 184
+ 10 % Pfeffer
85 185 015.026 S 28 - 10 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
86 186 Fettcoating + 5 % NaCl
87 187 + 10 % Nelken
88 188
+ 10 % Pfeffer
89 189 015.027 S 28 - 30 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
90 190 Fettcoating + 5 % NaCl
91 191 + 10 % Nelken
92 192
+ 10 % Pfeffer
93 193 015.028 S 28 - 50 % ohne Zusätze 2 °C 20 °C
94 194 Fettcoating + 5 % NaCl
95 195 + 10 % Nelken
96 196
+ 10 % Pfeffer
97 197 S 24 - Lyophilisat 2 °C 20 °C
98 198 S 25 - Lyophilisat 2 °C 20 °C
99 199 S 26 - Lyophilisat 2 °C 20 °C
100 200 S 28 - Lyophilisat 2 °C 20 °C
S 24: L. reuteri, S 25: L. rhamnosus, S 26: L. paracasei, S 28: L. gasseri

Eigene Untersuchungen
3.2.5.3 Mikrobiologische Untersuchung der Gewürze
Die für die Einlagerung der Proben verwendeten Gewürze, Nelken (gemahlen) und
Schwarzer Pfeffer (gemahlen), wurden zuvor mikrobiologisch untersucht.
Der Umfang der Untersuchungen richtete sich nach den Empfehlungen für die
Untersuchung von getrockneten Lebensmitteln von BAUMGART und BECKER
(2003). Bestimmt wurden die aerobe Gesamtkeimzahl, sowie Enterobacteriazeen,
Hefen und Schimmelpilze, aerobe Sporenbildner, sulfitreduzierende Clostridien,
Salmonellen und Milchsäurebakterien.
Die Bestimmung der aeroben Gesamtkeimzahl erfolgte im Spatelverfahren auf
Standard-I-Nähragar nach der vorgeschriebenen Methode (L 06.00-18) der
Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB.
Auf Enterobacteriazeen wurden die Gewürze im Spatelverfahren mit Überschichtung
auf VRBD-Agar mit der vorgeschriebenen Methode (L 06.00-24) gemäß Amtlicher
Sammlung von Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB untersucht.
Zum Nachweis von Hefen und Schimmelpilzen wurde im Plattengussverfahren auf
YGC-Agar mittels der vorgeschriebenen Methode (L 01.00-37) der Amtlichen
Sammlung von Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB untersucht.
In Anlehnung an die vorgeschriebene Methode (L 06.00-39) der Amtlichen
Sammlung von Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB wurde im
Plattengussverfahren auf mesophile sulfitreduzierende Clostridien untersucht. Als
Nährmedium wurde Tryptose-Sulfit-Cycloserin-Agar (TSC-Agar) verwendet.
Zum Nachweis von Salmonellen wurde aus der Amtlichen Sammlung von
Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB die vorgeschriebene Methode
(L 00.00.20) angewendet. Die Voranreicherung erfolgte in gepuffertem
Peptonwasser, die selektive Anreicherung in Salmonella-Anreicherungsbouillon nach
97

98
Eigene Untersuchungen
RAPPAPORT sowie in modifizierter TBG-Bouillon, das Ausstreichen auf
RAMBACH ® -Agar sowie auf XLD-Agar. Eine Bestätigung erfolgte nach Überimpfung
und Bebrütung charakteristischer Kolonien auf Standard-I-Nähragar mittels
serologischer Bestätigung. Nach Ausschluss selbstagglutinierender Stämme wurden
Einzelkolonien hinsichtlich ihrer Agglutination mit Serum I (A-E) und Serum II (F67)
überprüft.
Aerobe Sporenbildner wurden im Spatelverfahren mit den folgenden
Kultivierungsbedingungen untersucht: CASO-Agar, 30 °C ± 0,5 °C, 72 h ± 2 h
(BAUMGART u. BECKER 2003).
Auf Milchsäurebakterien wurde wie im Lagerungsversuch in Anlehnung an die in der
Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB
vorgeschriebene Methode (L 06.00-35) untersucht, d. h. MRS-Agar, Spatelverfahren,
37 °C ± 0,5 °C, 48 h ± 2 h und ein anaerobes Milieu wurden verwendet.
3.2.6 Untersuchung der Proben – Lagerungsversuch
Alle 200 verschiedenen Proben wurden zu Beginn der Lagerung und dann in
vierwöchigem Abstand über ein halbes Jahr untersucht.
Die Proben wurden jeweils in zwei Chargen, Proben-Nr. 1 - 100, sowie 101 - 200
untersucht (Tab.19).

Tabelle 19: Untersuchungszeitpunkte
Eigene Untersuchungen
Untersuchungs-Nr. Woche Datum Proben-Nr.
1 0 08.03.2006 1 - 100 = 101 - 200
2 4 04.04.2006 1 - 100
5 10.04.2006 101 - 200
3 8 03.05.2006 1 - 100
9 09.05.2006 101 - 200
4 12 31.05.2006 1 - 100
13 07.06.2006 101 - 200
5 16 27.06.2006 1 - 100
17 04.07.2006 101 - 200
6 20 25.07.2006 1 - 100
21 01.08.2006 101 - 200
7 24 23.08.2006 1 - 100
25 30.08.2006 101 - 200
Für die Untersuchung wurden die Proben im Wasserbad bei 30 °C ± 0,5 °C bis zur
Verflüssigung erwärmt und anschließend homogenisiert.
Von jeder homogenisierten Probe wurde, wie in Kapitel 3.2.2.1 beschrieben, eine
dezimale Verdünnungsreihe mit NaCl-Pepton-Lösung bis zu einer Verdünnung von
10 -8 angelegt. Die Untersuchung erfolgte im Doppelansatz mittels
Tropfplattenverfahren, wobei jede MRS-Agarplatte in maximal vier Sektoren unterteilt
wurde. Pro Sektor wurden 50 µl aufgetragen. Die Platten wurden 48 h ± 2 h bei
37 °C ± 0,5 °C im CO2-Brutschrank anaerob inkubiert. Nach 48 h ± 2 h erfolgte
makroskopisch und mikroskopisch die Auswertung der Platten und Berechnung des
gewichteten Mittelwertes und der Keimzahl pro ml bzw. g wie in Kapitel 3.2.2.1
beschrieben.
99

3.3 Auswertung
100
Eigene Untersuchungen
Jede Untersuchung zur Bestimmung der Keimzahl einer Probe wurde im
Doppelansatz durchgeführt, d. h. jede Verdünnungsstufe wurde auf zwei Platten
aufgetragen. Nach den festgelegten Bebrütungsdauern wurden die Kolonien
ausgezählt.
Um ein valides Ergebnis zu erhalten, wurde aus den Koloniezahlen der niedrigsten
und der nächsthöheren auswertbaren Verdünnungsstufe der gewichtete Mittelwert
mit der nachfolgenden Formel berechnet.
∑ c
c =
n ⋅1+
n ⋅0,
1
1
2
c gewichteter Mittelwert der Koloniezahlen
∑c Summe der Koloniezahlen aller Platten beider Verdünnungsstufen, die
zur Berechnung herangezogen werden (niedrigste und nächsthöhere
auswertbare Verdünnungsstufe)
n 1 Anzahl der Platten der niedrigsten auswertbaren Verdünnungsstufe
n 2 Anzahl der Platten der nächsthöheren Verdünnungsstufe
Die Keimzahl je g bzw. ml der Probe wurde durch Multiplikation des c -Wertes mit
den Verdünnungsfaktoren (Verdünnung und Plattenverdünnung) erhalten. Das
Ergebnis wurde auf eine Dezimalstelle nach dem Komma gerundet und als eine Zahl
zwischen 1,0 und 9,9 multipliziert mit der entsprechenden Zehnerpotenz angegeben.
Alle ermittelten Keimzahlen (KbE/ml bzw. KbE/g) wurden für die Darstellung der
Ergebnisse zur Basis Zehn logarithmiert (lg KbE/ml bzw. lg KbE/g) und auf zwei
Dezimalstellen nach dem Komma gerundet.

Eigene Untersuchungen
Die niedrigste Verdünnungsstufe lag bei 1,00 x 10 -1 . Dies entsprach beim
Tropfplattenverfahren einer niedrigsten Plattenverdünnungsstufe von 5,00 x 10 -3
(0,05 ml pro Plattensektor). Damit ergab sich durch Kehrwertbildung (1 ⁄ [5,00 x 10 -3 ])
eine Nachweisgrenze von 2,00 x 10 2 KbE/ml = 2,30 lg KbE/ml. Für Proben, bei
denen die Keimzahl unterhalb dieser Nachweisgrenze lag, wurde als absoluter Wert
die Hälfte von 2,00 x 10 2 KbE/ml, also 1,00 x 10 2 KbE/ml, angenommen.
1,00 x 10 2 KbE/ml wurde zur Basis Zehn logarithmiert, womit sich ein Wert von
2,00 lg KbE/ml ergab.
Beim Spatelverfahren lag die Nachweisgrenze bei
1,00 x 10 2 KbE/ml = 2,00 lg KbE/ml. Für Keimzahlen kleiner als die Nachweisgrenze
wurde mit 5,00 x 10 1 KbE/ml = 1,70 lg KbE/ml die halbe Nachweisgrenze festgelegt.
Die Nachweisgrenze im Gussplattenverfahren lag bei
1,00 x 10 1 KbE/ml = 1,00 lg KbE/ml. Werte, die unterhalb der Nachweisgrenze lagen,
wurden mit dem halben Wert, also 5,00 x 10 0 KbE/ml = 0,70 lg KbE/ml, angegeben.
Nach HILDEBRANDT und WICHMANN-SCHAUER (2005) sind wie alle
Analyseergebnisse auch die Resultate mikrobiologischer Keimzählverfahren mit
Messunsicherheiten behaftet. Die Messunsicherheit steht für die Präzision einer
Analyse.
Keimzahldifferenzen von mindestens |∆ KZ| = 0,70 lg KbE/ml galten bei den eigenen
Untersuchungen als eindeutige, also als methodenunabhängige Abweichungen.
Grundlage für die Festlegung dieses Wertes waren Präzisionsdaten aus
Ringversuchen, die in der Methode L 00.00-88 „Horizontales Verfahren für die
Zählung von Mikroorganismen“ der Amtlichen Sammlung von
Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB (= Norm DIN EN ISO 4833)
dargelegt sind.
Präzisionsdaten hängen von der Zusammensetzung der Keimflora und der Matrix der
Untersuchungsprobe ab. Die in der genannten Methode vorgelegten Daten wurden
aus Ringversuchen abgeleitet und für Rohmilch und pasteurisierte Milch validiert. Für
die Bestimmung der Koloniezahlen anderer Produkte dürfen diese als Schätzwerte
101

102
Eigene Untersuchungen
verwendet werden. Es wird unterschieden zwischen der Wiederholpräzision und der
Vergleichspräzision.
Die Wiederholpräzision bezeichnet die absolute Differenz zwischen zwei einzelnen
voneinander unabhängigen Untersuchungsergebnissen, die der gleiche Bearbeiter
mit den gleichen Verfahren an identischem Untersuchungsmaterial im gleichen Labor
mit der gleichen Geräteausstattung innerhalb einer kurzen Zeitspanne erhält. Der
Grenzwert für die Wiederholpräzision wird in der Methode L 00.00-88 „Horizontales
Verfahren für die Zählung von Mikroorganismen“ der Amtlichen Sammlung von
Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB mit r = 0,25 lg KbE/ml
angegeben.
Die Vergleichspräzision beschreibt die absolute Differenz zwischen zwei einzelnen
voneinander unabhängigen Untersuchungsergebnissen, die verschiedene Bearbeiter
mit dem gleichen Verfahren an identischem Untersuchungsmaterial in verschiedenen
Labors mit unterschiedlichen Geräteausstattungen erhalten. Gemäß der Methode
L 00.00-88 „Horizontales Verfahren für die Zählung von Mikroorganismen“ der
Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB ist
die Vergleichspräzision mit R = 0,45 lg KbE/ml anzunehmen.
Fasst man die genannten Werte für Wiederhol- und Vergleichspräzision (r und R)
zusammen, ergibt sich ein Wert von r + R = 0,70 lg KbE/ml. Auf diese Weise konnte
sicher gestellt werden, dass es sich bei Keimzahldifferenzen von mindestens
|∆ KZ| = 0,70 lg KbE/ml der eigenen Untersuchungen auf jeden Fall um eindeutige,
methodenunabhängige Abweichungen handelte. Es wurde durch die
Wiederholpräzision (r) der Personen-Methodenfehler, als auch durch die
Vergleichspräzision (R) der Interlabor-Methodenfehler berücksichtigt, obwohl alle
Ergebnisse von dem gleichen Bearbeiter durchgeführt worden sind.
Die weitere Auswertung der Ergebnisse des Lagerungsversuches, insbesondere die
Beschreibung der Unterschiede zwischen den Proben, erfolgte ausschließlich
deskriptiv.

4 Ergebnisse
Ergebnisse
In den Vorversuchen wurden zwölf verschiedene Gewürze sowie drei
Kochsalzkonzentrationen bezüglich ihres Einflusses auf das Wachstum der vier
verschiedenen probiotischen Bakterien L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),
L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) untersucht. Es wurden die zwei Gewürze
und die Kochsalzkonzentration mit den größten Einflüssen auf das
Bakterienwachstum für den angeschlossenen Lagerungsversuch ausgewählt. In dem
Lagerungsversuch wurden die genannten Einflüsse auf die Bakterien bei zwei
Lagerungstemperaturen untersucht. Die Bakterien wurden für die Lagerung
mikroverkapselt. Als Mikroverkapselungen wurden wasserlösliche wie auch
wasserunlösliche Coatingmaterialien, jeweils in drei unterschiedlichen
Kapselwandstärken, ausgewählt.
4.1 Vorversuche
Aus zwölf Gewürzen und drei Kochsalzkonzentrationen sollten in den Vorversuchen
zwei Gewürze sowie eine Kochsalzkonzentration für den angeschlossenen
Lagerungsversuch ausgewählt werden.
Makroskopisch betrachtet waren L. reuteri (S 24) glatte bis raue, mittelgroße,
wachsig-weiße, zentral hellere, leicht gewölbte Kolonien, L. rhamnosus (S 25) glatte,
große, strahlend-weiße, gewölbte Kolonien, L. paracasei (S 26) glatte, mittelgroße,
gewölbte Kolonien und L. gasseri (S 28) raue bis glatte, kleine, wachsig-weiße, sehr
feine, leicht gewölbte Kolonien.
Mikroskopisch stellten sich die Laktobazillen als grampositive Stäbchen dar. Bei
L. reuteri (S 24) handelte es sich um mittellange, bei L. rhamnosus (S 25) um kurze
103

104
Ergebnisse
bis mittellange Stäbchen, bei L. paracasei (S 26) um sehr schlanke, mittellange
Stäbchen und bei L. gasseri (S 28) um mittellange bis lange Stäbchen.
4.1.1 Vergleich von Spatel- und Tropfplattenverfahren
Im ersten Abschnitt der Vorversuche wurde zunächst die Vergleichbarkeit der
Ergebnisse aus Spatel- und Tropfplattenverfahren überprüft. Die gewichteten
arithmetischen Mittelwerte der Keimzahlen der Arbeitsbouillon (B1) von S 24, S 25,
S 26 und S 28 lagen in demselben Zehnerpotenzbereich. Die Abweichungen lagen
zwischen minimal 0,05 lg KbE/ml für S 26 (L. paracasei) und maximal 0,39 lg KbE/ml
für S 28 (L. gasseri). Für S 24 (L. reuteri) betrug die Abweichung 0,23 lg KbE/ml und
für S 25 (L. rhamnosus) 0,28 lg KbE/ml. Dabei ergaben sich aus dem
Tropfplattenverfahren jeweils die niedrigeren Werte. Es bestanden keine
methodenunabhängigen Unterschiede zwischen den beiden angewendeten
mikrobiologischen Verfahren, und eine Vergleichbarkeit der Ergebnisse konnte
nachgewiesen werden. In den nachfolgenden Versuchen wurde zwecks Kosten- und
Materialersparnis nur noch das Tropfplattenverfahren angewendet.
4.1.2 Einfluss Gewürze und Kochsalzkonzentration
Aus zwölf verschiedenen Gewürzen und drei Kochsalzkonzentrationen sollten zwei
Gewürze und eine Kochsalzkonzentration, die die größten Einflüsse auf das
Bakterienwachstum zeigten, ausgewählt werden.
Die aus der Arbeitsbouillon B1 erstellte MRS-Bouillon B2 diente als Kontrolle. Für
den ersten Untersuchungsgang (Gewürze 1 - 6 und Kochsalzkonzentrationen 1 %,
2 % und 5 %) ergaben sich im Tropfplattenverfahren folgende Keimzahlen für B1:
L. reuteri (S 24) 7,67 lg KbE/ml, L. rhamnosus (S 25) 8,98 lg KbE/ml, L. paracasei

Ergebnisse
(S 26) 9,46 lg KbE/ml und L. gasseri (S 28) 9,00 lg KbE/ml. Für B2 konnten folgende
Keimzahlen bestimmt werden: L. reuteri (S 24) 7,94 lg KbE/ml, L. rhamnosus (S 25)
7,99 lg KbE/ml, L. paracasei (S 26) 8,41 lg KbE/ml und L. gasseri (S 28)
9,74 lg KbE/ml.
Für den zweiten Untersuchungsgang (Gewürze 7 - 12) ergaben sich im
Tropfplattenverfahren folgende Keimzahlen für B1: L. reuteri (S 24) 8,00 lg KbE/ml,
L. rhamnosus (S 25) 8,96 lg KbE/ml, L. paracasei (S 26) 9,15 lg KbE/ml und
L. gasseri (S 28) 8,96 lg KbE/ml. Für B2 konnten folgende Keimzahlen bestimmt
werden: L. reuteri (S 24) 8,18 lg KbE/ml, L. rhamnosus (S 25) 8,56 lg KbE/ml,
L. paracasei (S 26) 9,81 lg KbE/ml und L. gasseri (S 28) 8,97 lg KbE/ml.
In den Negativkontrollen (B0) konnte makroskopisch und mikroskopisch kein
Wachstum festgestellt werden.
4.1.2.1 Einfluss Gewürze
Von zwölf untersuchten Gewürzen sollten die zwei Gewürze mit den größten
Einflüssen auf die Keimzahlen für den Lagerungsversuch ausgewählt werden. Die
Differenzen der Keimzahlen (∆ Kz) von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),
L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) mit und ohne Gewürz lagen zwischen -7,74
und 1,14. Die Tabellen 20 und 21 zeigen die Entwicklungen der Keimzahlen im
Einzelnen.
105

106
Ergebnisse
Tabelle 20: Keimzahlen (Kz) von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),
L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) unter dem Einfluss von
Gewürzen 1 - 6
L. reuteri
(S 24)
[lg KbE/ml]
L. rhamnosus
(S 25)
[lg KbE/ml]
L. paracasei
(S 26)
[lg KbE/ml]
L. gasseri
(S 28)
[lg KbE/ml]
Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz
B2 7,94 7,99 8,41 9,74
B2G1 8,77 0,83 7,79 -0,20 8,84 0,43 8,58 -1,16
B2G2 8,62 0,68 8,79 0,80 8,93 0,52 9,81 0,07
B2G3 2,00 -5,94 2,00 -5,99 2,00 -6,41 2,00 -7,74
B2G4 8,54 0,60 8,04 0,05 6,30 -2,11 8,11 -1,63
B2G5 7,78 -0,16 7,53 -0,46 7,68 -0,73 7,54 -2,20
B2G6 9,00 1,06 7,90 -0,09 6,23 -2,18 6,56 -3,18
B2 = MRS-Bouillon B2 (s. Abb. 8) = Kontrolle, B2GX = MRS-Bouillon B2 mit Zusatz von Gewürz GX,
G1 = Senfkörner, G2 = Paprika edelsüß, G3 = Nelken (gemahlen), G4 = Schwarzer Pfeffer
(gemahlen), G5 = Knoblauchgranulat, G6 = Ingwer (gemahlen), Kz = Keimzahl,
∆ Kz = Kz(B2GX) – Kz(B2), mit X = {1, 2, 3, 4, 5, 6}

Ergebnisse
Tabelle 21: Keimzahlen (Kz) von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),
L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) unter dem Einfluss von
Gewürzen 7 - 12
L. reuteri
(S 24)
[lg KbE/ml]
L. rhamnosus
(S 25)
[lg KbE/ml]
L. paracasei
(S 26)
[lg KbE/ml]
L. gasseri
(S 28)
[lg KbE/ml]
Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz
B2 8,18 8,56 9,81 8,97
B2G7 8,08 -0,10 8,60 0,04 8,99 -0,82 8,97 0,00
B2G8 8,26 0,18 7,49 -0,69 8,85 -0,96 9,48 0,51
B2G9 8,18 0,00 8,18 -0,38 8,56 -1,25 10,11 1,14
B2G10 9,15 0,97 8,72 0,16 8,98 -0,83 8,97 0,00
B2G11 9,08 0,90 8,88 0,32 8,80 -1,01 9,97 1,00
B2G12 8,23 0,05 7,45 -1,11 8,71 -1,10 7,32 -1,65
B2 = MRS-Bouillon B2 (s. Abb. 8) = Kontrolle, B2GX = MRS-Bouillon B2 mit Zusatz von Gewürz GX,
G7 = Rosenpaprika; G8 = Majoran (gemahlen), G9 = Kümmel (gemahlen); G10 = Zwiebelgranulat,
G11 = Basilikum (gerebelt), G12 = Oregano (gerebelt), Kz = Keimzahl, ∆ Kz = Kz(B2GX) – Kz(B2),
mit X = {7, 8, 9, 10, 11, 12}
In den Fällen, in denen ∆ Kz negativ war, waren die Keimzahlen der Bouillons mit
Gewürzzusatz (B2GX) kleiner als in der Kontrolle B2. Der Zusatz der Gewürze führte
in diesen Fällen zu einer Reduzierung des Keimwachstums. Ein erhöhtes
Keimwachstums im Vergleich zur Kontrolle B2 konnte im Falle von positiven ∆ Kz-
Werten festgestellt werden. ∆ Kz = 0 bedeutete, dass keine messbare gegenseitige
Beeinflussung zwischen Gewürzzusatz und Keimwachstum nachgewiesen werden
konnte. Eine Differenz von mindestens |∆ Kz| = 0,70 lg KbE/ml galt als eindeutig.
Nelken (gemahlen) führten im Vorversuch bei allen vier Stämmen zu einer
vollständigen Hemmung des Keimwachstums. Bei allen vier Stämmen lagen die
Keimzahlen der B2 mit Nelkenzusatz unterhalb der Nachweisgrenze. Es kam zu
eindeutigen Abnahmen der Keimzahlen. Folglich wurden Nelken als eines der beiden
Gewürze für den Lagerungsversuch ausgewählt. Auf diese Weise sollte der „worst
107

108
Ergebnisse
case“ simuliert werden, auch wenn Nelken als Gewürz eher selten in der Herstellung
von Fleischerzeugnissen zum Einsatz kommen.
Schwarzer Pfeffer (gemahlen) führte bei S 26 (L. paracasei) und S 28 (L. gasseri) zur
eindeutigen Reduzierung der Keimzahlen. Die Keimzahl von S 26 wurde unter dem
Einfluss von Schwarzem Pfeffer um 2,11 lg KbE/ml, die von S 28 um 1,63 lg KbE/ml
reduziert. Das Wachstum von S 24 (L. reuteri) und S 25 (L. rhamnosus) wurde durch
Schwarzen Pfeffer nicht eindeutig beeinflusst. ∆ Kz betrug für S 24 0,60 lg KbE/ml
und für S 25 0,05 lg KbE/ml. Schwarzer Pfeffer (gemahlen) wurde aufgrund der
eindeutigen, hemmenden Wirkung auf zwei der Bakterien, aber auch aufgrund des
häufigen Einsatzes in der Produktion von Fleischerzeugnissen, als zweites Gewürz
für die weiteren Versuche ausgewählt.
Die weiteren untersuchten Gewürze kamen für den Lagerungsversuch nicht in Frage,
da die Abnahmen der Keimzahlen im Vergleich zu Nelken und Schwarzem Pfeffer
geringer waren.
4.1.2.2 Einfluss Kochsalzkonzentration
Die drei Kochsalzkonzentrationen 1 %, 2 % und 5 % wurden hinsichtlich eines
Einflusses auf die Keimzahlen von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),
L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) untersucht. Es sollte die Konzentration mit
dem größten Einfluss auf das Bakterienwachstum ausgewählt werden. Die
Ergebnisse sind der Tabelle 22 zu entnehmen.

Ergebnisse
Tabelle 22: Keimzahlen (Kz) von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),
L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) unter dem Einfluss von
Kochsalz in verschiedenen Konzentrationen
L. reuteri
(S 24)
[lg KbE/ml]
L. rhamnosus
(S 25)
[lg KbE/ml]
L. paracasei
(S 26)
[lg KbE/ml]
L. gasseri
(S 28)
[lg KbE/ml]
Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz Kz ∆ Kz
B2 7,94 7,99 8,41 9,74
B2S1 7,72 -0,22 8,26 0,27 8,04 -0,37 8,60 -1,14
B2S2 6,30 -1,64 8,08 0,09 8,64 0,23 8,46 -1,28
B2S5 4,85 -3,09 7,65 -0,34 6,90 -1,51 7,54 -2,20
B2 = MRS-Bouillon B2 (s. Abb. 8) = Kontrolle, B2SX = MRS-Bouillon B2 mit Zusatz von NaCl SX,
S1 = 1 % NaCl-Zusatz, S2 = 2 % NaCl-Zusatz , S5 = 5 % NaCl-Zusatz, Kz = Keimzahl,
∆ Kz = Kz(B2SX) – Kz(B2), mit X = {1, 2, 5}
Für ∆ Kz < 0 waren die Keimzahlen der Bouillons mit Kochsalzzusatz (B2SX) kleiner
als in der Kontrolle B2, so dass der Zusatz von NaCl zu einer Reduzierung des
Keimwachstums führte. Eine Erhöhung der Keimzahlen im Vergleich zur Kontrolle B2
konnte für ∆ Kz > 0 festgestellt werden. ∆ Kz = 0 bedeutete wiederum, dass keine
messbare gegenseitige Beeinflussung zwischen Kochsalzzusatz und Keimwachstum
nachgewiesen werden konnte. Eine Differenz von mindestens
|∆ Kz| = 0,70 lg KbE/ml galt als methodenunabhängige Abweichung.
L. rhamnosus (S 25) zeigte sich gegenüber Kochsalz besonders resistent und 5 %
führten hier lediglich zu einer Reduzierung der Keimzahl um 0,34 lg KbE/ml. Die
Keimzahl von S 24 (L. reuteri) wurde durch 5 % NaCl-Zusatz um 3,09 lg KbE/ml, die
Keimzahl von S 26 (L. paracasei) um 1,51 lg KbE/ml und die Keimzahl von S 28
(L. gasseri) um 2,20 lg KbE/ml reduziert. 5 % Kochsalzzusatz führte also bei allen
vier Stämmen zu einer Reduzierung der Keimzahl, welche außer für S 25
(L. rhamnosus) auch methodenunabhängig war.
109

110
Ergebnisse
Die Einflüsse auf die Keimzahlen durch 1 % bzw. 2 % NaCl waren im Vergleich zu
5 % NaCl geringer, so dass in einem Versuchsansatz des Hauptversuches dem
Lagerungsmedium 5 % Kochsalz zugesetzt wurde.
4.1.3 Mikrobiologische Untersuchung der Gewürze
Die beiden Gewürze, die für den Lagerungsversuch verwendet werden sollten,
wurden zuvor hinsichtlich ihres Keimstatus untersucht. Eine Übersicht der
Keimbelastungen gibt Tabelle 23.
Tabelle 23: Keimbelastung der Gewürze Nelken und Schwarzer Pfeffer
Keimzahl [lg KbE/g Gewürz]
Untersuchter
Nelken
Schwarzer Pfeffer
Parameter
(gemahlen)
(gemahlen)
Aerobe GKZ
3,00 6,00
Enterobacteriaceae
Hefen und
Schimmelpilze
Sulfitreduzierende
Clostridien
Salmonella spp.
3,00 4,76
negativ in 10 g 3,00
1,00 3,18
negativ in 25 g negativ in 25 g
Aerobe Sporenbildner 3,00 6,00
Milchsäurebakterien nicht nachweisbar (< 1,70) nicht nachweisbar (< 1,70)
GKZ = Gesamtkeimzahl

Ergebnisse
Die Untersuchung der beiden Gewürze, die für die Einlagerung Verwendung finden
sollten, ergab eine nicht unerhebliche Belastung mit mehreren Keimen. Die
Belastung war bei Schwarzem Pfeffer (gemahlen) im Vergleich zu Nelken
(gemahlen) sehr viel höher. Milchsäurebakterien konnten in keiner der beiden
Proben nachgewiesen werden, wobei die Nachweisgrenze bei 2,00 lg KbE/g lag, und
als absoluter Wert hier die halbe Nachweisgrenze, also 1,70 lg KbE/g, angenommen
wurde.
4.2 Untersuchung der Proben – Lagerungsversuch
Die Proben (Probenschlüssel siehe Kap. 3.2.5.2, Tab. 18) wurden zum Zeitpunkt 0,
und anschließend zu sechs weiteren Untersuchungszeitpunkten in vierwöchigem
Abstand untersucht. Damit ergaben sich für jede Probe sieben Werte (U1 bis U7).
Makroskopisch und mikroskopisch stellten sich die Laktobazillen wie in den
Vorversuchen (siehe Kap. 4.1) dar.
Die Ergebnistabellen zu dem Lagerungsversuch mit den Keimzahlen der einzelnen
Untersuchungen sind im Anhang zu finden (siehe Kap. 10.1, Tab. 24 - 28).
4.2.1 Lagerung der Lyophilisate
Die Einzelergebnisse über den Verlauf der Keimzahlen der bei 2 °C (Nr. 97, 98, 99
und 100) und auch bei 20 °C (Nr. 197, 198, 199 und 200) gelagerten Lyophilisate
sind im Anhang (Kap. 10.1) in Tabelle 24 aufgeführt.
Die Lagerung der Proben bei 2 °C führte zu geringeren Abnahmen der Keimzahlen
als bei 20 °C. Die Keimzahlen von L. paracasei (S 26, Nr. 99) und L. gasseri
(S 28, Nr. 100) pro g Lyophilisat, gelagert bei 2 °C, blieben über den gesamten
Lagerungszeitraum sehr konstant. Es kam zu keinen eindeutigen Abnahmen der
111

112
Ergebnisse
Keimzahlen, d. h. |∆ Kz| < 0,70 lg KbE/g. Die Keimzahlen der anderen
Lyophilisatproben haben sich während des Lagerungszeitraumes eindeutig, aber
ebenfalls nur geringgradig verringert. Bei Raumtemperatur gelagerte Proben zeigten
im Vergleich zu den gekühlt gelagerten Proben deutlich höhere Abnahmen der
Keimzahlen über die Zeit. Am größten war hier die Abnahme mit 7,00 lg KbE/g bei
L. paracasei (S 26, Nr. 199), am kleinsten mit 2,38 lg KbE/g bei L. rhamnosus
(S 25, Nr. 198).
Insgesamt erwiesen sich die Lyophilisate bei einer gekühlten Lagerung über den
gesamten Zeitraum als sehr stabil, bei Raumtemperatur als relativ stabil. Die
Abbildung 11 stellt die Entwicklungen der Keimzahlen der Lyophilisate grafisch dar.
Keimzahl in lgKbE/g
11,00
10,00
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)
Lagerung bei 2 °C: Nr. 97-100, Lagerung bei 20 °C: Nr. 197-200, L. reuteri (S 24): Nr. 97, 197,
L. rhamnosus (S 25): Nr. 98, 198, L. paracasei (S 26): Nr. 99, 199, L. gasseri (S 28): Nr. 100, 200
Abbildung 11: Keimzahlen der Lyophilisate von L. reuteri (S 24),
97
98
99
100
197
198
199
200
L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) und L. gasseri
(S 28)

Ergebnisse
4.2.2 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. reuteri (S 24)
Die mikroverkapselten Proben von L. reuteri (S 24) wurden nur in Gelatine, mit
Zusatz von NaCl, mit Zusatz von Nelken bzw. mit Zusatz von Schwarzem Pfeffer bei
zwei Temperaturen gelagert, und im Laufe der Lagerung zu sieben
Untersuchungszeitpunkten untersucht. Die Tabelle 25 im Anhang (Kap. 10.1) zeigt
die Entwicklung der Keimzahlen der Proben von L. reuteri (S 24).
4.2.2.1 Ohne Zusätze
Für Proben von L. reuteri (S 24) nur in Gelatine ohne Zusätze gelagert (Nr. 1, 5, 9,
49, 53, 57, 101, 105, 109, 149, 153 und 157) ergaben sich im Wesentlichen
Unterschiede zwischen den bei verschiedenen Temperaturen gelagerten Proben
(siehe Abb. 12). Unabhängig von der Verkapselungsart kam es bei den bei 20°C
gelagerten Proben (Nr. 101, 105, 109, 149, 153 und 157) zu keinen eindeutigen
Abnahmen der Keimzahlen (Ausnahme: Nr. 105 mit ∆ Kz = -0,89). Unter den gekühlt
gelagerten Proben (Nr. 1, 5, 9, 49, 53 und 57) kam es im Vergleich zu den
wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 1, 5 und 9) bei den wasserunlöslich
verkapselten Proben (Nr. 49, 53 und 57) zu deutlich höheren Abnahmen der
Keimzahlen. Hierbei waren bei den wasserunlöslich verkapselten Proben (Nr. 49, 53
und 57) die Abnahmen umso geringer, je dicker die Kapsel war, d. h. bei der
50%igen Kapsel am geringsten. Bei den wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 1, 5
und 9) konnte dieser Befund nicht festgestellt werden.
113

Keimzahl in lgKbE/ml
114
11,00
10,00
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
Ergebnisse
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)
Lagerung bei 2 °C: Nr. 1, 5, 9, 49, 53, 57, Lagerung bei 20 °C: Nr. 101, 105, 109, 149, 153, 157,
wasserlösliches Coating: Nr. 1, 5, 9, 101, 105, 109, wasserunlösliches Coating: Nr. 49, 53, 57, 149,
153, 157, 10 % Coating: Nr. 1, 49, 101, 149, 30 % Coating: Nr. 5, 53, 105, 153, 50 % Coating: Nr. 9,
57, 109, 157
Abbildung 12: Keimzahlen von L. reuteri (S 24) ohne den Einfluss von
Zusätzen
4.2.2.2 Zusatz NaCl
Unter den Proben von L. reuteri (S 24), die in Gelatine mit dem Zusatz von 5 % NaCl
gelagert wurden, zeigten ebenfalls die bei 2 °C gelagerten Proben (Nr. 2, 6, 10, 50,
54 und 58) höhere eindeutige Abnahmen, als die bei 20 °C gelagerten Proben
(Nr. 102, 106, 110, 150, 154 und 158), was aus Abbildung 13 ersichtlich wird.
Auffällig ist, dass bereits zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung die Keimzahlen der
Proben mit der 10%igen wasserunlöslichen Kapsel (Nr. 50 und 150), unabhängig von
der Lagerungstemperatur, unter die Nachweisgrenze gesunken waren, so dass sich
in diesen Fällen ∆ Kz = 0 ergab. Des Weiteren gilt für die bei 2 °C gelagerten Proben,
1
5
9
49
53
57
101
105
109
149
153
157

Ergebnisse
dass die Abnahmen bei den wasserunlöslich verkapselten Proben (Nr. 50, 54 und
58) im Vergleich zu den wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 2, 6 und 10) geringer
waren. Für beide Verkapselungsarten ergaben sich bei dieser Lagerungstemperatur
umso geringere Abnahmen, je dicker die Kapsel war. Bei den bei 20 °C gelagerten
Proben kam es bei 30%iger und 50%iger wasserlöslicher (Nr. 106 und 110) sowie
wasserunlöslicher Kapsel (Nr. 154 und 158) zu methodenunabhängigen Zunahmen
der Keimzahlen über die Zeit, d. h. ∆ Kz war positiv.
Keimzahl in lgKbE/ml
11,00
10,00
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)
Lagerung bei 2 °C: Nr. 2, 6, 10, 50, 54, 58, Lagerung bei 20 °C: Nr. 102, 106, 110, 150, 154, 158,
wasserlösliches Coating: Nr. 2, 6, 10, 102, 106, 110, wasserunlösliches Coating: Nr. 50, 54, 58, 150,
154, 158, 10 % Coating: Nr. 2, 50, 102, 150, 30 % Coating: Nr. 6, 54, 106, 154, 50 % Coating: Nr. 10,
58, 110, 158
Abbildung 13: Keimzahlen von L. reuteri (S 24) unter dem Einfluss von
NaCl
2
6
10
50
54
58
102
106
110
150
154
158
115

4.2.2.3 Zusatz Nelken
116
Ergebnisse
Nelken (gemahlen) als Zusatz zum Lagerungsmedium führten, unabhängig von der
Verkapselungsart, bei L. reuteri (S 24) dazu, dass bereits zum Zeitpunkt der ersten
Untersuchung, d. h. direkt nach der Einlagerung der Proben, die Keimzahlen unter
die Nachweisgrenze gesunken waren (Nr. 3, 7, 11, 51, 55, 59, 103,107,111,151,155
und 159). An diesen Befunden änderte sich im weiteren Verlauf der Lagerung nichts,
so dass sich in diesen Fällen ∆ Kz = 0 ergab. Auf eine grafische Darstellung wurde in
diesem Fall verzichtet.
4.2.2.4 Zusatz Schwarzer Pfeffer
Proben von L. reuteri (S 24) mit dem Zusatz von Schwarzem Pfeffer gelagert (Nr. 4,
8, 12, 52, 56, 60, 104, 108, 112, 152, 156 und 160) zeigten, bis auf die Probe
Nr. 112, methodenunabhängige Abnahmen der Keimzahlen über die Zeit. Unter den
wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 4, 8, 12, 104, 108 und 112) zeigten die bei
20 °C gelagerten Proben (Nr. 104, 108 und 112) deutlich geringere Abnahmen als
die vergleichbaren Proben, die bei 2 °C gelagert wurden (Nr. 4, 8 und 12). Für beide
Lagerungstemperaturen waren in diesen Fällen die Abnahmen umso geringer, je
dicker die Kapsel war (Ausnahme Nr. 8). Unter den wasserunlöslich verkapselten
Proben (Nr. 52, 56, 60, 152, 156 und 160) gab es bei der 10%igen Kapsel keine
Unterschiede zwischen den Lagerungstemperaturen. Bei den 30%igen und 50%igen
wasserunlöslichen Kapseln kam es bei den bei 20 °C gelagerten Proben zu höheren
Abnahmen als bei den bei 2 °C gelagerten Proben. Eine Übersicht über die Lagerung
mit Schwarzem Pfeffer gibt die Abbildung 14.

Keimzahl in lgKbE/ml
11,00
10,00
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
Ergebnisse
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)
Lagerung bei 2 °C: Nr. 4, 8, 12, 52, 56, 60, Lagerung bei 20 °C: Nr. 104, 108, 112, 152, 156, 160,
wasserlösliches Coating: Nr. 4, 8, 12, 104, 108, 112, wasserunlösliches Coating: Nr. 52, 56, 60, 152,
156, 160, 10 % Coating: Nr. 4, 52, 104, 152, 30 % Coating: Nr. 8, 56, 108, 156, 50 % Coating: Nr. 12,
60, 112, 160
Abbildung 14: Keimzahlen von L. reuteri (S 24) unter dem Einfluss von
Schwarzem Pfeffer
4.2.3 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. rhamnosus (S 25)
Die mikroverkapselten Proben von L. rhamnosus (S 25) wurden ebenfalls nur in
Gelatine, mit Zusatz von NaCl, mit Zusatz von Nelken bzw. mit Zusatz von
Schwarzem Pfeffer bei zwei Temperaturen gelagert, und im Laufe der Lagerung zu
sieben Untersuchungszeitpunkten untersucht. Der Verlauf der Keimzahlen von
L. rhamnosus (S 25) kann aus Tabelle 26 im Anhang (Kap. 10.1) ersehen werden.
4
8
12
52
56
60
104
108
112
152
156
160
117

4.2.3.1 Ohne Zusätze
118
Ergebnisse
Bei allen Proben von L. rhamnosus (S 25), die ohne Zusätze in Gelatine gelagert
wurden (Nr. 13, 17, 21, 61, 65, 69, 113, 117, 121, 161, 165 und 169), kam es von der
ersten bis zur letzten Untersuchung zu methodenunabhängigen Abnahmen der
Keimzahlen. Unter den wasserlöslich verkapselten Proben waren die Abnahmen der
Keimzahlen der bei 20 °C gelagerten Proben (Nr. 113, 117 und 121) höher, als bei
den gekühlt gelagerten Proben (Nr. 13, 17 und 21). Im Falle der bei 20 °C gelagerten
Proben (Nr. 113, 117 und 121) waren die Abnahmen der Keimzahlen umso geringer,
je dickwandiger die Kapsel war, d. h. bei der 50%igen Kapsel (Nr. 121) am
geringsten. Unter den gekühlt gelagerten Proben zeigten die wasserunlöslich
verkapselten Proben (Nr. 61, 65 und 69) geringere Abnahmen als die wasserlöslich
verkapselten Proben (Nr. 13, 17 und 21). Außerdem waren die Abnahmen bei den
wasserunlöslichen Proben (Nr. 61, 65 und 69) umso geringer, je dicker die Kapsel
war. Hingegen zeigten die entsprechend verkapselten Proben bei 20 °C (Nr. 161,
165 und 169) eine Entwicklung in umgekehrter Richtung, d. h. die Abnahmen wurden
umso größer, je dicker die Kapsel wurde. Im Vergleich zu den ebenfalls bei 20 °C
gelagerten wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 113, 117 und 121), waren
zumindest für die 10%ig (Nr. 161) und 30%ig verkapselten Proben (Nr. 163) die
Abnahmen geringer. Eine Übersicht gibt die Abbildung 15, die jedoch noch mal
grafisch veranschaulicht, dass die Unterschiede zwischen den einzelnen Proben
gering waren.

Keimzahl in lgKbE/ml
11,00
10,00
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
Ergebnisse
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)
Lagerung bei 2 °C: Nr. 13, 17, 21, 61, 65, 69, Lagerung bei 20 °C: Nr. 113, 117, 121, 161, 165, 169,
wasserlösliches Coating: Nr. 13, 17, 21, 113, 117, 121, wasserunlösliches Coating: Nr. 61, 65, 69,
161, 165, 169, 10 % Coating: Nr. 13, 61, 113, 161, 30 % Coating: Nr. 17, 65, 117, 165, 50 % Coating:
Nr. 21, 69, 121, 169
Abbildung 15: Keimzahlen von L. rhamnosus (S 25) ohne den Einfluss von
Zusätzen
4.2.3.2 Zusatz NaCl
Bei den Proben von L. rhamnosus (S 25), die mit Zusatz von Kochsalz zur Gelatine
gelagert wurden (Nr. 14, 18, 22, 62, 66, 70, 114, 118, 122, 162, 166 und 170), kam
es bei den wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 14, 18, 22, 114, 118 und 122),
sowohl bei einer Lagerungstemperatur von 2 °C als auch von 20 °C, zu umso
geringeren Abnahmen der Keimzahlen, je dicker die Kapsel wurde. Im Fall der 50%ig
wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 22 und 122) kam es zu keinen eindeutigen
Veränderungen der Keimzahlen mehr. Die Abnahmen der Keimzahlen der
wasserunlöslich verkapselten Proben (Nr. 62, 66, 70, 162, 166 und 170) wurden
13
17
21
61
65
69
113
117
121
161
165
169
119

120
Ergebnisse
ebenso umso geringer, je dicker die Kapsel wurde. Hierbei waren die Abnahmen der
Keimzahlen der gekühlt gelagerten Proben geringer, als der Proben bei 20 °C-
Lagerung. Unter den bei 20 °C gelagerten Proben (Nr. 114, 118, 122, 162, 166 und
170) waren die Abnahmen bei den wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 114, 118
und 122) eindeutig geringer, als bei den wasserunlöslich verkapselten Proben
(Nr. 162, 166 und 170). In der nachfolgenden Abbildung 16 sind diese Ergebnisse
dargestellt.
Keimzahl in lgKbE/ml
11,00
10,00
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)
Lagerung bei 2 °C: Nr. 14, 18, 22, 62, 66, 70, Lagerung bei 20 °C: Nr. 114, 118, 122, 162, 166, 170,
wasserlösliches Coating: Nr. 14, 18, 22, 114, 118, 122, wasserunlösliches Coating: Nr. 62, 66, 70,
162, 166, 170, 10 % Coating: Nr. 14, 62, 114, 162, 30 % Coating: Nr. 18, 66, 118, 166, 50 % Coating:
Nr. 22, 70, 122, 170
Abbildung 16: Keimzahlen von L. rhamnosus (S 25) unter dem Einfluss von
NaCl
14
18
22
62
66
70
114
118
122
162
166
170

4.2.3.3 Zusatz Nelken
Ergebnisse
Nelken (gemahlen) als Zusatz zum Lagerungsmedium führten auch bei den Proben
von L. rhamnosus (S 25) (Nr. 15, 19, 23, 71, 115, 119, 123, und 171) unabhängig
von der Verkapselungsart und der Lagerungstemperatur dazu, dass die Keimzahlen
zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung, d. h. direkt nach der Einlagerung der
Proben, bereits unterhalb der Nachweisgrenze lagen. Ausnahmen bildeten die
Proben Nr. 63 und 67, sowie 163 und 167, d. h. die mit 10%iger und 30%iger
wasserunlöslicher Kapsel, bei 2 °C und auch bei 20 °C. Bei diesen Proben sanken
die Keimzahlen erst ab der dritten bzw. für Nr. 63 sogar erst ab der vierten
Untersuchung unter die Nachweisgrenze. Die Abbildung 17 stellt dies grafisch dar.
Keimzahl in lgKbE/ml
11,00
10,00
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)
Lagerung bei 2 °C: Nr. 63, 67, Lagerung bei 20 °C: Nr. 163, 167, wasserunlösliches Coating: Nr. 63,
67, 163, 167, 10 % Coating: Nr. 63, 163, 30 % Coating: Nr. 67, 167
Abbildung 17: Keimzahlen von L. rhamnosus (S 25) unter dem Einfluss von
Nelken
63
67
163
167
121

4.2.3.4 Zusatz Schwarzer Pfeffer
122
Ergebnisse
Proben von L. rhamnosus (S 25), die mit einem Zusatz von Schwarzem Pfeffer
gelagert wurden (Nr. 16, 20, 24, 64, 68, 72, 116, 120, 124, 164, 168 und 172), ließen
hinsichtlich der Entwicklung der Keimzahlen keine so eindeutigen Trends erkennen.
Unter den wasserunlöslich verkapselten Proben zeigten die bei 2 °C gelagerten
Proben (Nr. 64, 68 und 72) geringere Abnahmen der Keimzahlen auf, als die bei
20 °C gelagerten Proben (Nr. 164, 168 und 172). In beiden Fällen waren die
Abnahmen jedoch umso geringer, je dickwandiger die Kapseln waren. Unter den
wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 16, 20, 24, 116, 120 und 124) gab es bei
einer 20 °C-Lagerung keine wesentlichen Unterschiede zwischen den Proben mit
unterschiedlichen Kapselwandstärken; bei der 2 °C-Lagerung nahmen die
Abnahmen der Keimzahlen mit zunehmender Kapselwandstärke zu. Die Abbildung
18 verdeutlicht diese Ergebnisse.

Keimzahl in lgKbE/ml
11,00
10,00
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
Ergebnisse
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)
Lagerung bei 2 °C: Nr. 16, 20, 24, 64, 68, 72, Lagerung bei 20 °C: Nr. 116, 120, 124, 164, 168, 172,
wasserlösliches Coating: Nr. 16, 20, 24, 116, 120, 124, wasserunlösliches Coating: Nr. 64, 68, 72,
164, 168, 172, 10 % Coating: Nr. 16, 64, 116, 164, 30 % Coating: Nr. 20, 68, 120, 168, 50 % Coating:
Nr. 24, 72, 124, 172
Abbildung 18: Keimzahlen von L. rhamnosus (S 25) unter dem Einfluss von
Schwarzem Pfeffer
4.2.4 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. paracasei (S 26)
Die Lagerung der mikroverkapselten Proben von L. paracasei (S 26) erfolgte nur in
Gelatine, mit Zusatz von NaCl, mit Zusatz von Nelken bzw. mit Zusatz von
Schwarzem Pfeffer bei zwei Temperaturen. Die Proben wurden im Laufe der
Lagerung zu sieben Untersuchungszeitpunkten untersucht. Eine Übersicht über die
Keimzahlentwicklungen der Proben von L. paracasei (S 26) zeigt die Tabelle 27 im
Anhang (Kap. 10.1).
16
20
24
64
68
72
116
120
124
164
168
172
123

4.2.4.1 Ohne Zusätze
124
Ergebnisse
Ohne Zusätze in Gelatine bei 2 °C gelagerte Proben von L. paracasei (S 26) (Nr. 25,
29, 33, 73, 77 und 81) zeigten keine methodenunabhängigen Änderungen der
Keimzahlen, unabhängig von der Verkapselungsart (Ausnahmen: Nr. 25 und 81). Die
entsprechenden bei 20 °C gelagerten Proben (Nr. 125, 129, 133, 173, 177 und 181)
zeigten hingegen methodenunabhängige Abnahmen auf (siehe Abb. 19), wobei bei
den wasserunlöslich verkapselten Proben (Nr. 173, 177 und 181) umso geringere
Abnahmen festgestellt wurden, je dickwandiger die Kapseln waren.
Keimzahl in lgKbE/ml
11,00
10,00
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)
Lagerung bei 2 °C: Nr. 25, 29, 33, 73, 77, 81, Lagerung bei 20 °C: Nr. 125, 129, 133, 173, 177, 181,
wasserlösliches Coating: Nr. 25, 29, 33, 125, 129, 133, wasserunlösliches Coating: Nr. 73, 77, 81,
173, 177, 181, 10 % Coating: Nr. 25, 73, 125, 173, 30 % Coating: Nr. 29, 77, 129, 177, 50 % Coating:
Nr. 33, 81, 133, 181
Abbildung 19: Keimzahlen von L. paracasei (S 26) ohne den Einfluss von
Zusätzen
25
29
33
73
77
81
125
129
133
173
177
181

4.2.4.2 Zusatz NaCl
Ergebnisse
Proben von L. paracasei (S 26), die mit dem Zusatz von NaCl zur Gelatine gelagert
wurden (Nr. 26, 30, 34, 74, 78, 82, 126, 130, 134, 174, 178 und 182), wiesen unter
den wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 26, 30, 34, 126, 130 und 134) nur für die
Proben mit 10%igen Kapseln methodenunabhängige Abnahmen auf, welche bei
20 °C Lagerungstemperatur größer waren. Für wasserunlöslich verkapselte Proben
mit Zusatz von NaCl (Nr. 74, 78, 82, 174, 178 und 182) konnten lediglich für Proben
mit 30%igen Kapseln (Nr. 78 und 178), unabhängig von der Lagerungstemperatur,
sowie für Proben mit 50%igen Kapseln und einer Lagerungstemperatur von 2 °C
(Nr. 82), eindeutige Abnahmen festgestellt werden. Die nachfolgende Abbildung 20
gibt eine Übersicht über die Entwicklung der Keimzahlen.
Keimzahl in lgKbE/ml
11,00
10,00
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)
Lagerung bei 2 °C: Nr. 26, 30, 34, 74, 78, 82, Lagerung bei 20 °C: Nr. 126, 130, 134, 174, 178, 182,
wasserlösliches Coating: Nr. 26, 30, 34, 126, 130, 134, wasserunlösliches Coating: Nr. 74, 78, 82,
174, 178, 182, 10 % Coating: Nr. 26, 74, 126, 174, 30 % Coating: Nr. 30, 78, 130, 178, 50 % Coating:
Nr. 34, 82, 134, 182
Abbildung 20: Keimzahlen von L. paracasei (S 26) unter dem Einfluss von
NaCl
26
30
34
74
78
82
126
130
134
174
178
182
125

4.2.4.3 Zusatz Nelken
126
Ergebnisse
Proben von L. paracasei (S 26), die mit einem Zusatz von Nelken zum
Lagerungsmedium (Nr. 27, 31, 35, 75, 79, 83, 127, 131, 135, 175, 179 und 183)
gelagert wurden, wiesen, unabhängig von der Verkapselungsart und der
Lagerungstemperatur, zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung, d. h. direkt nach der
Einlagerung der Proben, bereits Keimzahlen auf, die unterhalb der Nachweisgrenze
lagen. An dieser Tatsache änderte sich im Verlauf der weiteren Untersuchungen
nichts mehr, weshalb auch auf eine grafische Darstellung verzichtet wurde.
4.2.4.4 Zusatz Schwarzer Pfeffer
Schwarzer Pfeffer als Zusatz zum Lagerungsmedium von L. paracasei (S 26) führte
bei den nicht gekühlt gelagerten Proben (Nr. 128, 132, 136, 176, 180 und 184)
unabhängig von der Verkapselungsart zu sehr viel höheren methodenunabhängigen
Abnahmen der Keimzahlen, als bei den entsprechenden gekühlt gelagerten Proben
(Nr. 28, 32, 36, 76, 80 und 84). Unter den gekühlt gelagerten Proben gab es keine
methodenunabhängigen Unterschiede zwischen den Proben mit unterschiedlichen
Verkapselungsarten (siehe Abb. 21).

Keimzahl in lgKbE/ml
11,00
10,00
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
Ergebnisse
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)
Lagerung bei 2 °C: Nr. 28, 32, 36, 76, 80, 84, Lagerung bei 20 °C: Nr. 128, 132, 136, 176, 180, 184,
wasserlösliches Coating: Nr. 28, 32, 36, 128, 132, 136, wasserunlösliches Coating: Nr. 76, 80, 84,
176, 180, 184, 10 % Coating: Nr. 28, 76, 128, 176, 30 % Coating: Nr. 32, 80, 132, 180, 50 % Coating:
Nr. 36, 84, 136, 184
Abbildung 21: Keimzahlen von L. paracasei (S 26) unter dem Einfluss von
Schwarzem Pfeffer
4.2.5 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. gasseri (S 28)
Die mikroverkapselten Proben von L. gasseri (S 28) wurden ebenfalls nur in
Gelatine, mit Zusatz von NaCl, mit Zusatz von Nelken bzw. mit Zusatz von
Schwarzem Pfeffer bei zwei Temperaturen gelagert, und im Laufe der Lagerung zu
sieben Untersuchungszeitpunkten untersucht. Die Tabelle 28 im Anhang (Kap. 10.1)
gibt eine Übersicht über die Entwicklung der Keimzahlen von L. gasseri (S 28).
28
32
36
76
80
84
128
132
136
176
180
184
127

4.2.5.1 Ohne Zusätze
128
Ergebnisse
Die Proben von L. gasseri (S 28), die nur in Gelatine ohne weitere Zusätze (Nr. 37,
41, 45, 85, 89, 93, 137, 141, 145, 185, 189 und 193) gelagert wurden, zeigten bei der
2 °C-Lagerung deutlich höhere Abnahmen als bei einer Lagerungstemperatur von
20 °C (siehe Abb. 22). Dies galt für die wasserlöslich verkapselten Proben (Nr. 37,
41, 45, 137, 141 und 145), wie auch für die wasserunlöslich verkapselten Proben
(Nr. 85, 89, 93, 185, 189, 193). Im Fall der wasserunlöslich verkapselten und bei
20 °C gelagerten Proben (Nr. 185, 189 und 193) kam es sogar zur Zunahme der
Keimzahlen.
Keimzahl in lgKbE/ml
11,00
10,00
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)
Lagerung bei 2 °C: Nr. 37, 41, 45, 85, 89, 93, Lagerung bei 20 °C: Nr. 137, 141, 145, 185, 189, 193,
wasserlösliches Coating: Nr. 37, 41, 45, 137, 141, 145, wasserunlösliches Coating: Nr. 85, 89, 93,
185, 189, 193, 10 % Coating: Nr. 37, 85, 137, 185, 30 % Coating: Nr. 41, 89, 141, 189, 50 % Coating:
Nr. 45, 93, 145, 193
Abbildung 22: Keimzahlen von L. gasseri (S 28) ohne den Einfluss von
Zusätzen
37
41
45
85
89
93
137
141
145
185
189
193

4.2.5.2 Zusatz NaCl
Ergebnisse
Die Lagerung von L. gasseri-Proben (S 28) mit dem Zusatz von NaCl zum
Lagerungsmedium (siehe Abb. 23) führte bei einer Lagerungstemperatur von 20 °C
(Nr. 138, 142, 146, 186, 190 und 194) zu geringeren Abnahmen der Keimzahlen als
bei 2 °C (Nr. 38, 42, 46, 86, 90, 94). Die wasserunlöslich verkapselten Proben mit
10%igen (Nr. 86 und 186) und 50%igen (Nr. 94 und 194) Kapseln zeigten bereits
zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung, d. h. direkt nach der Einlagerung der
Proben, Keimzahlen unterhalb der Nachweisgrenze auf. Für die 30%ig wasserlöslich
verkapselten Proben ergab sich bei 2 °C-Lagerung (Nr. 90) eine deutliche Abnahme
der Keimzahl; bei 20 °C-Lagerung (Nr. 190) kam es zu keinen
methodenunabhängigen Abnahmen.
Keimzahl in lgKbE/ml
11,00
10,00
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsr.)
Lagerung bei 2 °C: Nr. 38, 42, 46 86, 90, 94, Lagerung bei 20 °C: Nr. 138, 142, 146, 186, 190, 194,
wasserlösliches Coating: Nr. 38, 42, 46, 138, 142, 146, wasserunlösliches Coating: Nr. 86, 90, 94,
186, 190, 194, 10 % Coating: Nr. 38, 86, 138, 186, 30 % Coating: Nr. 42, 90, 142, 190, 50 % Coating:
Nr. 46, 94, 146, 194
Abbildung 23: Keimzahlen von L. gasseri (S 28) unter dem Einfluss von
NaCl
38
42
46
86
90
94
138
142
146
186
190
194
129

4.2.5.3 Zusatz Nelken
130
Ergebnisse
Unabhängig von der Verkapselungsart und der Lagerungstemperatur lagen die
Keimzahlen aller Proben von L. gasseri (S 28) mit Zusatz von Nelken zum
Lagerungsmedium (Nr. 39, 43, 47, 87, 91, 95, 139, 143, 147, 187, 191 und 195)
bereits zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung, d. h. unmittelbar nach Einlagerung
der Proben, unterhalb der Nachweisgrenze. Im Laufe der weiteren Untersuchungen
änderte sich darin nichts mehr, weshalb auch auf eine grafische Darstellung der
Ergebnisse verzichtet wurde.
4.2.5.4 Zusatz Schwarzer Pfeffer
Die Proben von L. gasseri (S 28), die mit Zusatz von Schwarzem Pfeffer gelagert
wurden (Nr. 40, 44, 48, 88, 92, 96, 140, 144, 148, 188, 192 und 196), zeigten bei der
gekühlten Lagerung geringere Abnahmen der Keimzahlen, als bei 20 °C gelagert.
Bei allen Proben kam es zu geringeren Abnahmen, je dickwandiger die Kapseln
waren (Ausnahmen: Nr. 96, 192). Die Abbildung 24 stellt diese Ergebnisse grafisch
dar.

Keimzahl in lgKbE/ml
11,00
10,00
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
Ergebnisse
0 (U1) 4-5 (U2) 8-9 (U3) 12-13 (U4) 16-17 (U5) 20-21 (U6) 24-25 (U7)
Lagerungszeit in Wochen (Untersuchungsnr.)
Lagerung bei 2 °C: Nr. 40, 44, 48, 88, 92, 94, Lagerung bei 20 °C: Nr. 140, 144, 148, 188, 192, 196,
wasserlösliches Coating: Nr. 40, 44, 48, 140, 144, 148, wasserunlösliches Coating: Nr. 88, 92, 96,
188, 192, 196, 10 % Coating: Nr. 40, 88, 140, 188, 30 % Coating: Nr. 44, 92, 144, 192, 50 % Coating:
Nr. 48, 96, 148, 196
Abbildung 24: Keimzahlen von L. gasseri (S 28) unter dem Einfluss von
Schwarzem Pfeffer
40
44
48
88
92
96
140
144
148
188
192
196
131

5 Diskussion
Diskussion
Ziel dieser Studie war es, die technologischen und mikrobiologischen Grundlagen für
den Einsatz mikroverkapselter Probiotika in Fleischerzeugnissen unterschiedlicher
Technologien, in Fleischzubereitungen und in Convenience-Erzeugnissen zu
erarbeiten.
Ausgewählte Laktobazillen mit probiotischer Wirkung wurden verschiedenen
Mikroverkapselungsverfahren unterzogen. In einem sich anschließenden
Lagerungsversuch wurden die mikroverkapselten Bakterien unterschiedlichen
Lagerungsbedingungen ausgesetzt und der Einfluss von Kochsalz und Gewürzen,
untersucht.
In einer Verlaufskontrolle, die sich über den Lagerungszeitraum erstreckte, wurde die
Lebensfähigkeit der mikroverkapselten Bakterien überprüft. Auf diese Weise wurde
untersucht, ob die mikroverkapselten Laktobazillen für einen Einsatz u. a. in
Gewürzmischungen und essbaren Hüllen in den oben genannten Produkten geeignet
sind.
5.1 Verwendete Bakterien
Bei den verwendeten Bakterienstämmen handelte es sich um Re-Isolate aus
verschiedenen probiotischen Produkten, d. h. um definierte lebende
Mikroorganismen, die in ausreichender Menge in aktiver Form in den Darm gelangen
und hierbei positive gesundheitliche Effekte erzielen. In probiotischen Lebensmitteln
sind die Probiotika in einer Menge enthalten, bei der die probiotischen Wirkungen
nach dem Verzehr eines derartigen Lebensmittels erzielt werden (ARBEITSGRUPPE
„PROBIOTISCHE MIKROORGANISMENKULTUREN IN LEBENSMITTELN“ AM
BUNDESINSTITUT FÜR GESUNDHEITLICHEN VERBRAUCHERSCHUTZ UND
VETERINÄRMEDIZIN (jetzt: BfR) 2000).
133

134
Diskussion
Es wurden Re-Isolate aus Produkten ausgewählt. Auf diese Weise konnte man
davon ausgehen, dass die probiotischen Wirkungen der Bakterien bereits
nachgewiesen wurden. Als Stämme wurden vier weit verbreitete Laktobazillen
ausgewählt.
Speziell handelte es sich um die probiotischen Stämme L. reuteri (S 24),
L. rhamnosus (S 25) und L. paracasei (S 26), alle isoliert aus probiotischen
Milcherzeugnissen, und L. gasseri (S 28), isoliert aus einem humanmedizinischen
Probiotikum in Kapselform.
Wie erwartet stellten sich die Stämme entsprechend den Beschreibungen in der
Literatur dar. Vertreter der Gattung Lactobacillus sind grampositive kurze bis lange,
z. T. auch kokkoide Stäbchen (BAUMGART u. BECKER 2003).
KANDLER et al. (1980) und HAMMES und VOGEL (1995) beschreiben L. reuteri als
ein wenig irregulär gekrümmtes Stäbchen, 0,7 - 1,0 µm x 2,0 - 5,0 µm groß, mit
abgerundeten Enden, einzeln, in Paaren oder kleinen Gruppen. L. reuteri (S 24) als
mittellanges Stäbchen konnte in den eigenen Untersuchungen bestätigt werden.
Nach COLLINS et al. (1989) sowie HAMMES und VOGEL (1995) erscheint
L. paracasei stäbchenförmig, 0,8 - 1,0 µm x 2,0 - 4,0 µm groß, häufig mit breiten
Enden, einzeln oder in Ketten, nicht beweglich. L. rhamnosus ist ebenfalls
stäbchenförmig, 0,8 - 1,0 µm x 2,0 - 4,0 µm groß, häufig mit breiten Enden, einzeln
oder in Ketten, nicht beweglich. Entsprechend konnten in den eigenen
Untersuchungen L. rhamnosus (S 25) als kurze bis mittellange Stäbchen und
L. paracasei (S 26) als sehr schlanke, mittellange Stäbchen nachgewiesen werden.
L. gasseri stellt sich nach LAUER und KANDLER (1980) und HAMMES und VOGEL
(1995) mikroskopisch als Stäbchen mit abgerundeten Enden dar, mit einer Größe
von 0,6 - 0,8 µm x 3,0 - 5,0 µm und kommt einzeln oder in Ketten vor. In den eigenen
Untersuchungen konnte ebenfalls gezeigt werden, dass es sich bei L. gasseri (S 28)
um mittellange bis lange Stäbchen handelte.
Makroskopisch betrachtet waren L. reuteri (S 24) glatte bis raue, mittelgroße,
wachsig-weiße, zentral hellere, leicht gewölbte Kolonien, L. rhamnosus (S 25) glatte,
große, strahlend-weiße, gewölbte Kolonien, L. paracasei (S 26) glatte, mittelgroße,

Diskussion
gewölbte Kolonien und L. gasseri (S 28) raue bis glatte, kleine, wachsig-weiße, sehr
feine, leicht gewölbte Kolonien.
5.2 Vorversuche
In den Vorversuchen wurden die Bedingungen für den Lagerungsversuch
ausgetestet. Untersucht wurde der Einfluss von zwölf verschiedenen Gewürzen,
Nelken (gemahlen), Schwarzer Pfeffer (gemahlen), Knoblauchgranulat, Oregano
(gerebelt), Ingwer (gemahlen), Senfkörner, Basilikum (gerebelt), Rosen-Paprika
(gemahlen), Paprika edelsüß (gemahlen), Majoran (gemahlen), Zwiebelgranulat und
Kümmelgranulat (gemahlen), sowie von Kochsalz in drei verschiedenen
Konzentrationen (1 %, 2 % bzw. 5 %) auf das Wachstum der vier verschiedenen
Bakterienstämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) und
L. gasseri (S 28).
5.2.1 Vergleich von Spatel- und Tropfplattenverfahren
Im ersten Abschnitt der Vorversuche wurde die Vergleichbarkeit der Ergebnisse aus
Spatel- und Tropfplattenverfahren überprüft. Die gewichteten Mittelwerte der
Keimzahlen der Arbeitsbouillon (B1) von S 24, S 25, S 26 und S 28 lagen in
demselben Zehnerpotenzbereich. Es bestanden also keine eindeutigen Unterschiede
zwischen den beiden angewendeten mikrobiologischen Verfahren, und eine
Vergleichbarkeit der Ergebnisse konnte nachgewiesen werden. Dies war insofern zu
erwarten, da beide Verfahren nach der Amtlichen Sammlung von
Untersuchungsverfahren (BVL 2005) nach § 64 LFGB zugelassen sind. Die Qualität
der eigenen Arbeitsweise und der Laborbedingungen konnte so noch einmal
bestätigt werden. In den nachfolgenden Versuchen wurde zwecks Kosten- und
Materialersparnis nur noch das Tropfplattenverfahren angewendet.
135

5.2.2 Einfluss Gewürze
136
Diskussion
Alle Gewürze mit ätherischen Ölen und isolierte ätherische Öle wirken mehr oder
weniger stark antimikrobiell (TEUSCHER 2003). Bei zahlreichen Gewürzen sind die
ätherischen Öle Träger der antimikrobiellen Wirksamkeit (NARAHIMSARAO u.
NIGAM 1970).
Die antimikrobielle Wirksamkeit von Gewürzen auf vier probiotische
Bakterienstämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) und
L. gasseri (S 28) sollte in den Vorversuchen untersucht werden. Von zwölf
untersuchten Gewürzen sollten die zwei Gewürze mit den größten Einflüssen auf die
Keimzahlen für den Lagerungsversuch ausgewählt werden.
Nelken (gemahlen) führten im Vorversuch bei allen vier Stämmen zu einer
vollständigen Hemmung des Keimwachstums. Bei allen vier Stämmen lagen die
Keimzahlen der MRS-Bouillon (B2) mit Nelkenzusatz unterhalb der Nachweisgrenze
von 2,30 lg KbE/ml. Es kam zu methodenunabhängigen Abnahmen der Keimzahlen,
weshalb Nelken als eines der beiden Gewürze für den Lagerungsversuch
ausgewählt wurde. Auf diese Weise sollte der „worst case“ simuliert werden, auch
wenn Nelken als Gewürz eher selten in der Herstellung von Fleischerzeugnissen
zum Einsatz kommen.
Die gute antimikrobielle Wirkung von Extrakten aus Gewürznelken und Nelkenöl
zeigten auch HITOKOTO et al. (1980), BRIOZZO et al. (1989), BEUCHAT (1994)
sowie DORMAN und DEANS (2000). Nach MABROUK und EL-SHAYEP (1980) wird
das Wachstum mycotoxigener Pilze und deren Mycotoxinbildung bereits durch 0,1 %
Nelkenpulver im Substrat völlig unterdrückt. ZAIKA u. KISSINGER (1979) konnten
nachweisen, dass Nelken eine Starterkultur, bestehend aus L. plantarum und
P. cerevisiae, ab 4,0 g/l hemmten, niedrigere Konzentrationen (0,5 - 2,0 g/l) die
Säureproduktion stimulierten. Für die Laktobazillen-Spezies mit den untersuchten
Stämmen L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) und L. gasseri
(S 28) lagen bezüglich der Wirkung von Nelken noch keine Ergebnisse in der
Literatur vor.

Diskussion
Schwarzer Pfeffer (gemahlen) führte bei L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) zur
methodenunabhängigen Reduzierung der Keimzahlen. Die Keimzahl von
L. paracasei (S 26) wurde unter dem Einfluss von Schwarzem Pfeffer um
2,11 lg KbE/ml, die von L. gasseri (S 28) um 1,63 lg KbE/ml reduziert. Das
Wachstum von L. rhamnosus (S 25) wurde durch Schwarzen Pfeffer nicht eindeutig
beeinflusst, obwohl L. rhamnosus wie L. paracasei zu der L. casei-Gruppe gehört
(KLEIN et al. 1998). Das Wachstum von L. reuteri (S 24) wurde ebenfalls nicht
beeinflusst. Schwarzer Pfeffer (gemahlen) wurde aufgrund der
methodenunabhängigen, hemmenden Wirkung auf zwei der Bakterien, aber auch
aufgrund des häufigen Einsatzes in der Produktion von Fleischerzeugnissen, als
zweites Gewürz für die weiteren Versuche ausgewählt.
HUHTANEN (1980), MABROUK und EL-SHAYEP (1980), ISMAIEL und PIERSON
(1990), PEREZ und ANESINI (1994) und DORMAN und DEANS (2000) wiesen
ebenso nach, dass ethanolische Pfefferextrakte oder ätherisches Pfefferöl
antibakteriell wirken. Nach ROY et al. (1988) und EL-KADY et al. (1995) wird das
Wachstum mycotoxigener Schimmelpilze aber offenbar nicht beeinflusst, da Pfeffer
hohe Konzentrationen an Aflatoxinen enthalten kann.
Für die Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) und
L. gasseri (S 28), die in den eigenen Untersuchungen eingesetzt wurden, lagen
bezüglich der Wirkung von Schwarzem Pfeffer keine Vergleiche in der Literatur vor.
GONZALEZ-FANDOS et al. (1996) konnten jedoch zeigen, dass Schwarzer Pfeffer in
Konzentrationen von 5 %, wobei in den eigenen Untersuchungen 10 % eingesetzt
wurden, eine antimikrobielle Wirkung auf in der Wurstfermentation eingesetzte
Laktobazillen (L. plantarum DSM 20174, L. curvatus DSM 20019, L. sakei DSM
20017) und Pediokokken (P. damnosus DSM 20031) ausübt.
Die weiteren untersuchten Gewürze kamen für den Lagerungsversuch nicht in Frage,
da die Abnahmen der Keimzahlen im Vergleich zu Nelken und Schwarzem Pfeffer
geringer waren.
137

5.2.3 Einfluss Kochsalzkonzentration
138
Diskussion
In den Vorversuchen wurde der Einfluss von 1 %, 2 % und 5 % NaCl auf die
Keimzahlen von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) und
L. gasseri (S 28) untersucht, wobei 5 % als Zusatz in Fleischerzeugnissen oder
sonstigen Produkten schon vergleichsweise hoch ist.
L. rhamnosus (S 25) zeigte sich gegenüber Kochsalz besonders resistent und 5 %
führten hier lediglich zu einer Reduzierung der Keimzahl um 0,34 lg KbE/ml. Die
Keimzahl von L. reuteri (S 24) wurde durch 5 % NaCl-Zusatz um 3,09 lg KbE/ml, die
Keimzahl von L. paracasei (S 26) um 1,51 lg KbE/ml und die Keimzahl von L. gasseri
(S 28) um 2,20 lg KbE/ml reduziert. 5 % Kochsalzzusatz führte also bei allen vier
Stämmen zu einer Reduzierung der Keimzahl, welche außer für L. rhamnosus (S 25)
auch methodenunabhängig war. Obwohl L. paracasei (S 26) wie L. rhamnosus
(S 25) zur L. casei-Gruppe gehört (KLEIN et al. 1998) wurde dieser durch 5 % NaCl-
Zusatz eindeutig im Wachstum beeinträchtigt.
Nach AXELSSON (2004) gilt für alle Lactobacillus-Spezies, dass bei 18 % NaCl kein
Wachstum mehr stattfindet, das Wachstum in Gegenwart von 6,5 % NaCl ist
hingegen speziesabhängig. Die speziesspezifische Eigenschaft der Toleranz
gegenüber NaCl konnte in den Vorversuchen bestätigt werden. Konkrete Aussagen
darüber, wie viel Kochsalz, welche Lactobacillus-Spezies toleriert, lagen in der
Literatur nicht vor.
Die Einflüsse auf die Keimzahlen durch 1 % bzw. 2 % NaCl waren im Vergleich zu
5 % NaCl geringer, weshalb für den Lagerungsversuch einer Charge des
Lagerungsmediums 5 % Kochsalz zugesetzt wurde.
5.3 Lyophilisation
Die probiotischen Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26)
und L. gasseri (S 28) wurden durch die Firma THT SA lyophilisiert. Die Lyophilisate

Diskussion
wurden mit einer Konzentration von mindestens 10 10 KbE/g hergestellt. Diese
Konzentration erschien sinnvoll aufgrund der Tatsache, dass die empfohlene täglich
aufzunehmende, minimale therapeutische Dosis für probiotische Bakterien bei
10 8 bis 10 9 KbE liegt, um probiotische Effekte zu erzielen, wobei die Empfehlung für
das probiotische Produkt am Ende des Mindesthaltbarkeitsdatums bei 10 6 KbE pro
ml liegt (SHAH 2000, KAILASAPATHY u. CHIN 2000). Nach SANDERS u. HUIS IN’T
VELD (1999) erscheint auf der Basis von In-vitro-Studien sogar eine täglich
aufzunehmende Dosis von 10 9 bis 10 10 KbE probiotischer Bakterien notwendig, um
probiotische Effekte zu erzielen.
Durch die Qualitätssicherung von THT SA am Ende der Lyophilisation wurde
sichergestellt, dass es zu keiner Kontamination des Probenmaterials kam. Es wurde
auf coliforme Keime, Enterobacteriaceae sowie Hefen und Schimmelpilze untersucht.
5.4 Mikroverkapselung
Die Mikroverkapselung der lyophilisierten Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus
(S 25), L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) erfolgte durch die Firma Micap ®
GmbH, Bremerhaven, Deutschland. Zweck der Mikroverkapselung ist im
Zusammenhang mit Lebensmitteln der Schutz des verkapselten Materials oder des
aufnehmenden Lebensmittels vor verschiedenen schädlichen Einflüssen (KUNZ et
al. 2003).
Die Wahl der Verkapselungsmethode richtet sich, ebenso wie die Auswahl der
Materialien (hydrophile bzw. hydrophobe Substanzen), nach der Verwendungsform
und dem Anwendungsbereich (HOBEIN u. LUTZ 1989).
Um möglichst verschiedene Verwendungsformen und Anwendungsbereiche
abdecken zu können, erfolgte die Verkapselung der probiotischen Stämme sowohl
mit einem wasserlöslichen (Maltodextrin, native Maisstärke), als auch mit einem
wasserunlöslichen (gehärtetes, raffiniertes Pflanzenfett auf der Basis von laurinfreien
Fetten, Zuckerester, Methylcellulose) Coating. Jedes der beiden Coatingverfahren
139

140
Diskussion
wurde in drei unterschiedlichen Formulierungen, die auch industriell üblich sind,
erstellt, d. h. mit 10 %, 30 % bzw. 50 % Kapselanteil. Als Verkapselungsverfahren
wurde das für die Firma Micap ® GmbH Verfahren der Wahl angewendet. Das sog.
Wirbelschicht-Coating (Fließbett-Beschichtung) schließt fluidisierende Partikel durch
Besprühen mit Kapselmaterial in der Wirbelschicht ein (KUNZ et al. 2003).
Es wurde durch die Firma Micap ® GmbH garantiert, dass die Produkttemperatur
während des gesamten Prozesses bei 34 - 37 °C lag, um die eingesetzten Stämme
nicht negativ zu beeinträchtigen. Mit 34 - 37 °C wurde der optimale
Temperaturbereich bezüglich des Wachstums der Laktobazillen nicht überschritten
(BAUMGART u. BECKER 2003).
Die Verkapselung erfolgte unter sterilen Bedingungen, so dass eine Kontamination
während des Herstellungsprozesses nahezu ausgeschlossen werden kann. Eine
Qualitätssicherung diesbezüglich, wie bei den Lyophilisaten, erfolgte durch die
Micap ® GmbH nicht.
Auch konnten seitens der Firma Micap ® GmbH keine Angaben über Konzentrationen
im verkapselten Produkt gemacht werden. Es wurden jedoch zu Beginn des
Lagerungsversuchs (erste Untersuchung zum Zeitpunkt Null, U1) vergleichend in
allen Proben die Konzentrationen bestimmt, so dass auf diese Auskunft verzichtet
werden konnte.
5.5 Lagerungsversuch
5.5.1 Mikrobiologische Untersuchung der Gewürze
Die Keimzahl von Kräutern und Gewürzen kann mit bis zu 10 7 KbE/g vergleichsweise
hoch sein (BECKMANN et al. 1996). Die Infektionsgefahren für den Menschen sind
jedoch als gering einzuschätzen, da in der Regel während Herstellungs- und
Kochprozessen die Mikroorganismen abgetötet werden (TEUSCHER 2003).
Die beiden Gewürze (Nelken und Schwarzer Pfeffer), die für den Lagerungsversuch
verwendet werden sollten, wurden folglich zuvor hinsichtlich ihres Keimstatus

Diskussion
untersucht. Hierbei ergab sich eine nicht unerhebliche Keimbelastung mit mehreren
Spezies, wie auch von BECKMANN et al. (1996) und TEUSCHER (2003)
beschrieben. Die Belastung war im Vergleich zu Nelken (gemahlen) bei Schwarzem
Pfeffer (gemahlen) sehr viel höher. Unter den kontaminierenden Mikroorganismen
waren, wie auch bei TEUSCHER (2003), aerobe Sporenbildner (Nelken:
3,00 lg KbE/g; Schwarzer Pfeffer: 6,00 lg KbE/g) sowie Hefen und Schimmelpilze
(Nelken: negativ in 10 g; Schwarzer Pfeffer: 3,00 lg KbE/g). Ebenfalls nachgewiesen
wurden aber auch Enterobacteriazeen (Nelken: 3,00 lg KbE/g; Schwarzer Pfeffer:
4,76 lg KbE/g) und sulfitreduzierende Clostridien (Nelken: 1,00 lg KbE/g; Schwarzer
Pfeffer: 3,18 lg KbE/g). Nicht nachweisbar waren Salmonellen (negativ in 25 g).
Milchsäurebakterien konnten ebenfalls in keiner der beiden Proben nachgewiesen
werden, wobei die Nachweisgrenze bei 2,00 lg KbE/g lag, und als absoluter Wert hier
die halbe Nachweisgrenze, also 1,70 lg KbE/g, angenommen wurde. Insbesondere
das Nichtvorhandensein von Milchsäurebakterien, speziell Laktobazillen, war eine
wichtige Voraussetzung für den nachfolgenden Lagerungsversuch.
Die von BECKMANN et al. (1996) beschriebene vergleichsweise hohe
Keimbelastung von Gewürzen konnte bestätigt werden. Die Richt- und Warnwerte
der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie für Gewürze, die zur
Abgabe an den Verbraucher bestimmt sind oder in der untersuchten Form dem
Lebensmittel zugesetzt und keinem keimreduzierenden Verfahren unterworfen
werden (DGHM 1988), wurden hingegen nicht überschritten.
5.5.2 Einlagerung und Untersuchung der Proben
Die Lyophilisate der vier Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei
(S 26) und L. gasseri (S 28) wurden in den Lagerungsversuch mit einbezogen. Dazu
wurden 1 g ± 0,1 g der Lyophilisate in autoklavierte Röhrchen steril eingewogen, so
dass es zu keiner Kontamination kommen konnte.
141

142
Diskussion
Als Lagerungsmedium für die mikroverkapselten Stämme L. reuteri (S 24),
L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) wurde Speisegelatine
ausgewählt, da diese eine häufige Zutat in Fleischerzeugnissen ist und zudem gute
Träger- und Bindungseigenschaften aufweist. Speziell wurde die GELITA ®
Speisegelatine, 240 Bloom 20 mesh PS, ausgewählt, und in einer üblichen
Verdünnung 100 g pro 900 ml Aqua. dest. angesetzt und gelöst. In diesem Verhältnis
erwies sich die Gelatine als stabil und zeigte gute Geliereigenschaften. Je 10 ml
wurden in die Lagerungsröhrchen abgefüllt und bei 121 °C ± 0,5 °C autoklaviert
(Lagerungsmedium Nr. 1). Der Kochverlust durch das Autoklavieren verteilte sich wie
auch bei den Nährmedien und Lösungen auf alle Röhrchen in gleichem Maße.
Nach Auswertung der Vorversuche (siehe Kap. 3.2.2) wurden, wie bereits in Kapitel
5.2 diskutiert, für den Lagerungsversuch als Zusätze 5 % NaCl (Lagerungsmedium
Nr. 2), 10 % Nelken (Lagerungsmedium Nr. 3) bzw. 10 % Schwarzer Pfeffer
(Lagerungsmedium Nr. 4) ausgewählt, da diese zu einer deutlichen Beeinträchtigung
des Wachstums der vier probiotischen Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus
(S 25), L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) führten.
Die Probenröhrchen wurden bei zwei Temperaturen gelagert: gekühlt bei
2 °C ± 0,5 °C, sowie bei einer Raumtemperatur von 20 °C ± 0,5 °C. Die
zugelassenen Temperaturschwankungen während der Lagerung betrafen wiederum
alle Proben in gleichem Maße.
Die 200 verschiedenen Proben wurden zu Beginn der Lagerung (Zeitpunkt Null, U1)
und anschließend zu sechs weiteren Untersuchungszeitpunkten (U2, U3, U4, U5, U6
und U7) in vierwöchigem Abstand untersucht. Damit ergaben sich für jede Probe
sieben Werte (U1 bis U7). Der Probenschlüssel ist in Kapitel 3.2.5.2 (Tab. 18) und
die Untersuchungszeitpunkte in Kapitel 3.2.6 (Tab. 19) aufgeführt. Die Proben
Nr. 101 bis 200, d. h. die bei 20 °C gelagerten Proben, wurden aus labortechnischen
Gründen jeweils maximal eine Woche später untersucht, was aber alle Proben in
gleichem Maße betraf und daher keine Auswirkungen auf die Ergebnisse hatte.

5.5.2.1 Lagerung der Lyophilisate
Diskussion
Nach PIKAL (1999) stellt die Lyophilisation ein besonders schonendes Verfahren
dar, um thermolabile Stoffe von Wasser zu befreien. Durch den Entzug von Wasser
werden physikalische und chemische Verfahren verhindert und kinetische
Umbauprozesse verlangsamt (PIKAL 1999). Dementsprechend erwiesen sich die
Lyophilisate insgesamt bei einer gekühlten Lagerung über den gesamten Zeitraum
als sehr stabil, bei Raumtemperatur als relativ stabil.
Die Keimzahlen von L. paracasei (S 26, Nr. 99) und L. gasseri (S 28, Nr. 100) pro g
Lyophilisat blieben bei einer Lagerungstemperatur von 2 °C über den gesamten
Lagerungszeitraum sehr konstant. Es kam zu keinen methodenunabhängigen
Abnahmen der Keimzahlen. Die Keimzahlen der anderen Lyophilisatproben haben
sich während des Lagerungszeitraumes methodenunabhängig, aber ebenfalls nur
geringgradig verringert. Die Keimzahl von L. rhamnosus (S 25, Nr. 98) nahm um
0,83 lg KbE/g und die von L. reuteri (S 24, Nr. 97) um 1,34 lg KbE/g ab.
Bei Raumtemperatur gelagerte Proben zeigten im Vergleich zu den gekühlt
gelagerten Proben deutlich höhere Abnahmen der Keimzahlen über die Zeit. Am
größten war hier die Abnahme mit 7,00 lg KbE/g bei L. paracasei (S 26, Nr. 199), am
kleinsten mit 2,38 lg KbE/g bei L. rhamnosus (S 25, Nr. 198), obwohl beide Stämme
Vertreter der L. casei-Gruppe sind (KLEIN et al. 1998).
Die Lagerung der Proben bei 2 °C führte zu geringeren Abnahmen der Keimzahlen
als bei 20°C. Ein solcher Temperatureinfluss auf die Lyophilisate ist in der Literatur
nicht beschrieben. Es wurde jedoch von der Firma THT SA eine gekühlte Lagerung
empfohlen.
143

144
Diskussion
5.5.2.2 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. reuteri (S 24)
Entgegen den Erwartungen beeinflusste eine Temperatur von 20 °C L. reuteri (S 24)
nur in Gelatine ohne Zusätze gelagert nicht. Eine gekühlte Lagerung beeinflusste die
Proben hingegen schon. Zunächst sieht es so aus, dass die Verkapselung hier keine
Rolle spielte. Vergleicht man diese Ergebnisse jedoch mit den Ergebnissen des
entsprechenden Lyophilisates, das bei 20 °C gelagert wurde, so fällt auf, dass es
dort schon zu methodenunabhängigen Abnahmen bei einer 20 °C-Lagerung kam. Es
ist also anzunehmen, dass durch die Verkapselung der von MUSCHIOLIK und
NAUMANN (2002) beschriebene Schutzeffekt der eingeschlossenen Komponenten
eingetreten ist.
Unter den gekühlt gelagerten Proben kam es im Vergleich zu den wasserlöslich
verkapselten Proben bei den wasserunlöslich verkapselten Proben zu deutlich
höheren Abnahmen der Keimzahlen, obwohl die Proben in einem wässrigen Milieu
gelagert wurden. Hierbei waren bei den wasserunlöslich verkapselten Proben die
Abnahmen umso geringer, je dicker die Kapsel war. Besserer Schutz durch eine
dickwandigere Kapsel erscheint sinnvoll, nicht erklärbar ist hingegen, warum dies bei
den wasserlöslich verkapselten Proben nicht festgestellt werden konnte.
Auch bei Proben von L. reuteri (S 24) mit dem Zusatz von 5 % NaCl erwies sich eine
Lagerung bei 20 °C besser als bei 2 °C. Auffällig ist, dass bereits zum Zeitpunkt der
ersten Untersuchung die Keimzahlen der Proben mit der 10%igen wasserunlöslichen
Kapsel, unabhängig von der Lagerungstemperatur, unter die Nachweisgrenze von
2,30 lg KbE/ml gesunken waren, dickwandigere Kapseln aber einen effektiveren
Schutz boten. Des Weiteren gilt für die bei 2 °C gelagerten Proben, dass die
Abnahmen bei den wasserunlöslich verkapselten Proben im Vergleich zu den
wasserlöslich verkapselten Proben geringer waren. Dies ist insofern erklärbar, da es
sich um ein wasserlösliches Lösungsmittel handelte. Nicht erklärbar ist hingegen,
warum sich diese Proben aber genau umgekehrt zu den Proben ohne NaCl-Zusatz
verhielten. Die Keimzahlen der Proben mit den wasserlöslichen Kapseln sind bereits
ab der zweiten Untersuchung unter die Nachweisgrenze von 2,30 lg KbE/ml

Diskussion
gesunken. Für die wasserunlöslich verkapselten Proben war dies erst ab der vierten
Untersuchung der Fall. Für beide Verkapselungsarten ergaben sich bei dieser
Lagerungstemperatur umso geringere Abnahmen, je dicker die Kapsel war. Die
Kapselwandstärke bestimmte also auch hier den Grad des Schutzeffektes.
Nelken (gemahlen) als Zusatz zum Lagerungsmedium führten, unabhängig von der
Verkapselungsart, bei L. reuteri (S 24) dazu, dass bereits zum Zeitpunkt der ersten
Untersuchung, d. h. direkt nach der Einlagerung der Proben, die Keimzahlen unter
die Nachweisgrenze gesunken waren. Gegen die starke antimikrobielle Wirkung von
Nelken (HITOKOTO et al. 1980, BRIOZZO et al. 1989, BEUCHAT 1994, DORMAN u.
DEANS 2000) konnten auch die verschiedenen Verkapselungen keinen wirksamen
Schutz darstellen.
Proben von L. reuteri (S 24), die mit dem Zusatz von Schwarzem Pfeffer gelagert
wurden, zeigten, bis auf die Probe Nr. 112 (50 % wasserlösliches Coating, 20 °C
Lagerungstemperatur), methodenunabhängige Abnahmen der Keimzahlen über die
Zeit. Die antimikrobielle Wirkung ethanolischer Pfefferextrakte oder ätherischer
Pfefferöle wurde auch hier deutlich (HUHTANEN 1980, MABROUK u. EL-SHAYEP
1980, ISMAIEL u. PIERSON 1990, PEREZ u. ANESINI 1994, DORMAN u. DEANS
2000).
Unter den wasserlöslich verkapselten Proben zeigten die bei 20 °C gelagerten
Proben deutlich geringere Abnahmen als die vergleichbaren Proben, die bei 2 °C
gelagert wurden, so dass sich auch hier eine höhere Lagerungstemperatur als
vorteilhaft erwies. Ebenfalls vorteilhaft war auch hier eine dickwandigere Kapsel.
Unter den wasserunlöslich verkapselten Proben gab es bei der 10%igen Kapsel
keine Unterschiede zwischen den Lagerungstemperaturen. Bei den 30%igen und
50%igen wasserunlöslichen Kapseln kam es bei den bei 20 °C gelagerten Proben zu
höheren Abnahmen als bei den bei 2 °C gelagerten Proben, im Gegensatz zu den
wasserlöslich verkapselten Proben.
145

146
Diskussion
5.5.2.3 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. rhamnosus (S 25)
Die mikroverkapselten Proben von L. rhamnosus (S 25) wurden ebenfalls nur in
Gelatine, mit Zusatz von NaCl, mit Zusatz von Nelken bzw. mit Zusatz von
Schwarzem Pfeffer bei zwei Temperaturen gelagert, und im Laufe der Lagerung zu
sieben Untersuchungszeitpunkten untersucht.
Bei allen Proben von L. rhamnosus (S 25), die in Gelatine ohne weitere Zusätze
gelagert wurden, kam es von der ersten bis zur letzten Untersuchung zu
methodenunabhängigen Abnahmen der Keimzahlen. Eine gekühlte Lagerung erwies
sich im Fall der wasserlöslich verkapselten Proben als günstig.
Eine dickwandige Kapsel war für die bei 20 °C gelagerten Proben vorteilhaft. Unter
den gekühlt gelagerten Proben zeigten die wasserunlöslich verkapselten Proben
geringere Abnahmen als die wasserlöslich verkapselten Proben, zudem waren bei
den wasserunlöslich verkapselten Proben dickwandigere Kapseln besser.
Hingegen zeigten die entsprechend verkapselten Proben bei 20 °C eine Entwicklung
in umgekehrter Richtung, so dass hier auch die Lagerungstemperatur eine Rolle
gespielt hat. Insgesamt waren die Unterschiede zwischen den einzelnen Proben sehr
gering, so dass Lagerungstemperatur und Verkapselungsart wenig Einfluss zeigten.
Bei den Proben von L. rhamnosus (S 25), die mit Zusatz von Kochsalz zur Gelatine
gelagert wurden, war es unter den wasserlöslich verkapselten Proben unabhängig
von der Lagerungstemperatur besser, je dickwandiger die Kapsel war.
Entsprechendes gilt für die wasserunlöslich verkapselten Proben, hierbei stellte sich
hingegen eine gekühlte Lagerung als weiterer Vorteil heraus. Bei einer
Lagerungstemperatur von 20 °C stellten die wasserlöslichen Kapseln einen besseren
Schutz dar als die wasserunlöslichen.
Die gute antimikrobielle Wirkung von Nelken (HITOKOTO et al. 1980, BRIOZZO et
al. 1989, BEUCHAT 1994, DORMAN u. DEANS 2000) zeigte sich auch bei den
Proben von L. rhamnosus (S 25) mit Nelkenzusatz zum Lagerungsmedium, wobei
Verkapselungsart und Lagerungstemperatur keinen Einfluss hatten. Ausnahmen

Diskussion
bildeten die Proben mit 10%iger und 30%iger wasserunlöslicher Kapsel, bei 2 °C und
auch 20 °C. Bei diesen Proben sanken die Keimzahlen erst ab der dritten bzw. für
Nr. 63 (10 % wasserunlösliches Coating, 2 °C Lagerungstemperatur) sogar erst ab
der vierten Untersuchung unter die Nachweisgrenze von 2,30 lg KbE/ml, so dass hier
als absoluter Wert dann mit 2,00 lg KbE/ml die halbe Nachweisgrenze angenommen
wurde. Nicht erklärbar ist jedoch, warum dies nicht für die 50%igen Kapseln galt.
Proben von L. rhamnosus (S 25), die mit einem Zusatz von Schwarzem Pfeffer, der
antibakteriell wirksam ist (HUHTANEN 1980, MABROUK u. EL-SHAYEP 1980,
ISMAIEL u. PIERSON 1990, PEREZ u. ANESINI 1994, DORMAN u. DEANS 2000),
gelagert wurden, ließen hinsichtlich der Entwicklung der Keimzahlen keine so
eindeutigen Trends erkennen. Wasserunlöslich verkapselte Proben zeigten bei 2 °C
gelagert geringere Abnahmen als bei 20 °C. Dickwandige Kapseln waren jedoch
wiederum vorteilhaft. Unter den wasserlöslich verkapselten Proben scheint bei einer
20 °C-Lagerung die Kapselwandstärke keine Rolle gespielt zu haben, bei der 2 °C-
Lagerung hat sich eine dickere Kapselwandstärke sogar negativ ausgewirkt.
5.5.2.4 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. paracasei (S 26)
Eine Lagerung nur in Gelatine bei 2 °C und die Verkapselungsart beeinflussten die
Proben von L. paracasei (S 26) im Gegensatz zu den entsprechenden Proben von
L. rhamnosus (S 25) nicht. Dies ist insofern erstaunlich, da L. paracasei und
L. rhamnosus beide zu der L. casei-Gruppe gehören (KLEIN et al. 1998). Solche
Unterschiede innerhalb der Gruppe konnten auch bereits in den Vorversuchen
gezeigt werden. Die Lagerung bei 20 °C führte hingegen zu einer Beeinträchtigung
der Proben, wobei sich bei einer wasserunlöslichen Verkapselung eine
dickwandigere Kapsel als vorteilhafter erwies.
Proben von L. paracasei (S 26) konnten vor dem Einfluss von NaCl durch 30%ige
und 50%ige wasserlösliche Kapseln geschützt werden, eine 10%ige Verkapselung
147

148
Diskussion
war nicht ausreichend. Zusätzlich erwies sich eine Lagerung bei niedrigerer
Temperatur als vorteilhaft. Die Temperatur spielte bei den entsprechenden Proben
von L. rhamnosus (S 25) keine Rolle.
Die Ergebnisse für die wasserunlöslich verkapselten Proben von L. paracasei (S 26)
sind widersprüchlich. Hier konnte lediglich durch 10%ige Kapseln unabhängig von
der Lagerungstemperatur, sowie für 50%ige Kapseln bei einer Lagerungstemperatur
von 20 °C ein schützender Effekt festgestellt werden.
Auch Proben von L. paracasei (S 26) konnten durch keine der untersuchten
Verkapselungsmethoden und keine der beiden Lagerungstemperaturen wirksam vor
der starken antimikrobiellen Wirkung von Nelken (HITOKOTO et al. 1980, BRIOZZO
et al. 1989, BEUCHAT 1994, DORMAN u. DEANS 2000) geschützt werden.
Die antimikrobielle Wirkung von Schwarzem Pfeffer (HUHTANEN 1980, MABROUK
u. EL-SHAYEP 1980, ISMAIEL u. PIERSON 1990, PEREZ u. ANESINI 1994,
DORMAN u. DEANS 2000) auf L. paracasei (S 26) wurde durch die
Verkapselungsart nicht beeinflusst. Die Lagerung bei einer Temperatur von 2 °C
erwies sich als vorteilhaft.
5.5.2.5 Lagerung mikroverkapselter Proben von L. gasseri (S 28)
Für L. gasseri (S 28) ohne weitere Zusätze war, wie auch für L. reuteri (S 24),
unabhängig von der Verkapselungsart eine Lagerung bei 20 °C besser als eine
Lagerung bei 2 °C. Dies galt für die wasserlöslich verkapselten Proben wie auch für
die wasserunlöslich verkapselten Proben. Im Fall der wasserunlöslich verkapselten
und bei 20 °C gelagerten Proben kam es sogar zur Zunahme der Keimzahlen.
Bezüglich der Lagerungstemperatur gilt für L. gasseri (S 28) mit dem Zusatz von
NaCl das Gleiche wie oben aufgeführt für die Proben ohne Zusätze. Unerklärlich ist,
warum die Keimzahlen der wasserunlöslich verkapselten Proben mit 10%igen und

Diskussion
50%igen Kapseln bereits zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung, d. h. direkt nach
der Einlagerung der Proben, unterhalb der Nachweisgrenze von 2,30 lg KbE/ml
lagen, die mit der 30%igen Kapsel hingegen nicht.
Die eingesetzten Verkapselungsmethoden konnten L. gasseri (S 28) bei beiden
Lagerungstemperaturen nicht ansatzweise vor der starken antimikrobiellen Wirkung
von Nelken (HITOKOTO et al. 1980, BRIOZZO et al. 1989, BEUCHAT 1994,
DORMAN u. DEANS 2000) schützen, so dass die Keimzahlen dieser Proben bereits
zum Zeitpunkt der ersten Untersuchung, d. h. unmittelbar nach Einlagerung der
Proben, unterhalb der Nachweisgrenze lagen.
Bei einem Zusatz von Schwarzem Pfeffer war für L. gasseri (S 28) eine Lagerung bei
2 °C vorteilhafter als bei 20 °C. Hier liegt ein Widerspruch zu den Proben ohne
Zusätze bzw. mit dem Zusatz NaCl vor. Auch in diesem Fall boten wiederum die
dickwandigeren Kapseln einen effektiveren Schutz gegen die antimikrobielle Wirkung
von Schwarzem Pfeffer (HUHTANEN 1980, MABROUK u. EL-SHAYEP 1980,
ISMAIEL u. PIERSON 1990, PEREZ u. ANESINI 1994, DORMAN u. DEANS 2000).
5.6 Zusammenfassende Diskussion und Ausblick
Die vier probiotischen Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei
(S 26) und L. gasseri (S 28) verhielten sich unter den Verkapselungs- und
Lagerungsbedingungen individuell sehr unterschiedlich. Es kann folglich keine
allgemeine Empfehlung für die Mikroverkapselung probiotischer Bakterien gegeben
werden. Es sind ansatzweise Schutzeffekte durch die Mikroverkapselung erkennbar,
welche jedoch für die individuelle Anwendung spezifisch zu untersuchen sind. Am
ehesten Erfolg versprechend ist wohl L. rhamnosus (S 25) wasserunlöslich
verkapselt und gekühlt gelagert.
149

150
Diskussion
Es war sinnvoll in Vorversuchen die Kochsalzkonzentration (5 %) und die zwei
Gewürze (Nelken, Schwarzer Pfeffer) mit den größten Einflüssen auf das Wachstum
der vier Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) und
L. gasseri (S 28) auszuwählen, da so eventuelle Schutzeffekte durch die
Verkapselungen am deutlichsten wurden.
Es scheint möglich, die probiotischen Laktobazillen in Fleischerzeugnissen
einzusetzen, auch wenn diese durch Zusätze wie Gewürze und Kochsalz in ihrem
Wachstum beeinflusst werden. In spezifischen Fällen kann sich eine
Mikroverkapselung der Bakterien förderlich auf das Überleben der Keime auswirken.
Weitergehende Studien zu dem Verhalten in entsprechenden Produkten sind
notwendig, da in der vorliegenden Studie die Bedingungen nur simuliert wurden.
Produkte mit definierten Gewürzmischungen (z. B. ohne Nelken) können gezielt
getestet werden und eine Eignung kann außerhalb der „worst case“-Szenarien
geprüft werden.
Die für diese Arbeit durchgeführten Mikroverkapselungen stellten einen erheblichen
finanziellen Aufwand dar. Im industriellen Maßstab angewendet, würden die Kosten
sicherlich deutlich sinken, da es sich um größere Chargen handeln und nur eine
Verkapselungsart angewendet würde, die technologischen Entwicklungsarbeiten also
schon durchgeführt worden wären. In diesem Rahmen wären die Kosten vermutlich
vertretbar, wobei Kostenberechnungen für den Einzelfall durchzuführen wären.
Außerdem bleibt offen, ob in dieser Studie die optimalen Verkapselungstechnologien
ausgewählt wurden, auch wenn es sich dabei um industriell übliche Verfahren und
Materialien handelte. Vielleicht müssen speziell für die Anwendung von probiotischen
Bakterien in Fleischerzeugnissen auch noch ganz neue Verkapselungsmaterialien
und -verfahren entwickelt werden, die an die speziellen Milieubedingungen (z. B.
Kochsalzkonzentration, Gewürzzusätze) angepasst sind.

Diskussion
Des Weiteren wird noch in Studien nachzuweisen sein, ob die verwendeten Stämme
L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) trotz
der Mikroverkapselungen und der Lagerungsbedingungen ihre probiotischen
Wirkungen beibehalten haben.
151

6 Schlussfolgerungen
Schlussfolgerungen
Aus den diskutierten Ergebnissen können zusammenfassend die folgenden
Schlussfolgerungen gezogen werden.
1. Die zwölf untersuchten Gewürze beeinflussten das Wachstum der vier
probiotischen Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26)
und L. gasseri (S 28). Den größten Einfluss zeigten Nelken, gefolgt von
Schwarzem Pfeffer.
2. Kochsalz beeinflusste ebenfalls das Wachstum der untersuchten Stämme, wobei
ein Zusatz von 5 % zu einer deutlichen Reduzierung der Keimzahlen führte.
3. Die Lyophilisate der probiotischen Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),
L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) erwiesen sich über den gesamten
Lagerungszeitraum von sechs Monaten bei einer gekühlten Lagerung als sehr
stabil, bei Raumtemperatur als relativ stabil.
4. L. reuteri (S 24) zeigte in verkapselter Form unabhängig vom Lagerungsmedium
bei 20 °C ein besseres Wachstum als bei 2 °C.
5. L. rhamnosus (S 25) erwies sich unabhängig von Lagerungstemperatur,
Verkapselungsart und Lagerungsmedium als sehr stabil. Eine Ausnahme bildete
der Zusatz von Nelken.
6. Das Wachstum von L. paracasei (S 26) wurde durch eine gekühlte Lagerung
begünstigt. Wasserlösliche, dickwandige Kapseln bewährten sich besser als
andere Kapseln.
7. L. gasseri (S 28) zeigte bei 20 °C gelagert ein besseres Wachstum. Bei einem
Zusatz von Schwarzem Pfeffer war hingegen eine gekühlte Lagerung
vorteilhafter.
8. Insgesamt erwiesen sich in der Regel dickwandigere Kapseln als vorteilhaft.
153

154
Schlussfolgerungen
9. Vor der sehr starken antimikrobiellen Wirkung von Nelken konnte keine der
Verkapselungsarten die probiotischen Bakterien schützen. Eine Ausnahme stellte
L. rhamnosus (S 25) dar. Hierbei zeigten die 10%igen und 30%igen
wasserunlöslichen Kapseln für die ersten drei bis vier Monate einen Schutzeffekt.
10. Die vier probiotischen Stämme L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),
L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) verhielten sich unter den
Verkapselungs- und Lagerungsbedingungen individuell sehr unterschiedlich.
11. Es sind ansatzweise Schutzeffekte durch die Mikroverkapselung erkennbar, diese
sind jedoch für jede individuelle Anwendung spezifisch zu untersuchen. Es kann
keine allgemeine Empfehlung für die Mikroverkapselung probiotischer Bakterien
und deren Einsatz in Fleischerzeugnissen gegeben werden.
12. Es scheint möglich, die probiotischen Laktobazillen in Fleischerzeugnissen
einzusetzen, auch wenn diese durch Zusätze wie Gewürze und Kochsalz in ihrem
Wachstum beeinflusst werden.

7 Zusammenfassung
Julia Nina Jähne
Zusammenfassung
Entwicklung von mikroverkapselten Probiotika-Präparaten zum Einsatz als
Zusatzstoff in Fleischerzeugnissen
Ziel dieser Studie war es, die technologischen und mikrobiologischen Grundlagen für
den Einsatz mikroverkapselter Probiotika in Fleischerzeugnissen zu erarbeiten. Es
wurden die vier verschiedenen probiotischen Stämme Lactobacillus reuteri (S 24),
Lactobacillus rhamnosus (S 25), Lactobacillus paracasei (S 26) und Lactobacillus
gasseri (S 28) hinsichtlich eines möglichen Einsatzes als Zusatzstoff in
Fleischerzeugnissen untersucht. Getestet wurden der Einfluss verschiedener
Gewürze und Kochsalzkonzentrationen, sowie unterschiedliche
Mikroverkapselungen und Lagerungstemperaturen.
In Vorversuchen wurde die Wirkung von zwölf verschiedenen Gewürzen und drei
Kochsalzkonzentrationen auf das Wachstum der vier probiotischen Keime
untersucht. Es wurde die Wirkung von Nelken (gemahlen), Schwarzem Pfeffer
(gemahlen), Knoblauchgranulat, Oregano (gerebelt), Ingwer (gemahlen),
Senfkörnern, Basilikum (gerebelt), Rosen-Paprika (gemahlen), Paprika edelsüß
(gemahlen), Majoran (gemahlen), Zwiebelgranulat und Kümmel (gemahlen)
untersucht. Kochsalz wurde zu 1 %, 2 % und 5 % zugesetzt. Für einen sich
anschließenden Lagerungsversuch wurden die Zusätze mit den größten Einflüssen
auf die probiotischen Stämme ausgewählt: 5 % Kochsalz, 10 % Nelken bzw. 10 %
Schwarzer Pfeffer.
Die Laktobazillen wurden lyophilisiert und anschließend mikroverkapselt. Jeder
Stamm wurde einerseits wasserlöslich mit einem Maltodextrincoating und
andererseits auch wasserunlöslich mit einem Fettcoating verkapselt. Jedes der
155

156
Zusammenfassung
beiden Coatingverfahren wurde in drei unterschiedlichen Formulierungen erstellt:
10 %, 30 % bzw. 50 % Kapselanteil.
Jede dieser mikroverkapselten Proben wurde in einer Gelatinelösung 1. ohne
Zusätze, 2. mit Zusatz von 5 % NaCl, 3. mit Zusatz von 10 % Nelken bzw. 4. mit
Zusatz von 10 % Schwarzem Pfeffer bei 2 °C und bei 20 °C über einen Zeitraum von
sechs Monaten gelagert. Parallel dazu wurden die unverkapselten Lyophilisate
ebenfalls bei 2 °C und bei 20 °C gelagert.
In einer Verlaufskontrolle wurde zu Beginn und dann in vierwöchigem Abstand die
Keimzahl der Proben auf MRS-Agar bestimmt.
Die Lyophilisate der probiotischen Keime L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),
L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) erwiesen sich über den gesamten
Lagerungszeitraum von sechs Monaten bei einer gekühlten Lagerung als sehr stabil,
bei Raumtemperatur als relativ stabil.
Die vier Stämme probiotischer Laktobazillen verhielten sich unter den
Verkapselungs- und Lagerungsbedingungen individuell sehr unterschiedlich. Es sind
ansatzweise Schutzeffekte durch die Mikroverkapselung erkennbar. Gegen die
starke antimikrobielle Wirkung von Nelken konnte bis auf anfänglich bei
L. rhamnosus (S 25) kein Coating wirksam schützen. Dickwandigere Kapseln
schützten in der Mehrzahl der Fälle wirksamer. Lactobacillus reuteri (S 24) und
Lactobacillus gasseri (S 28) zeigten bei 20 °C ein besseres Wachstum. Lactobacillus
rhamnosus (S 25) erwies sich insgesamt als sehr stabil. Das Wachstum von
Lactobacillus paracasei (S 26) wurde durch eine gekühlte Lagerung und
wasserlösliche, dickwandige Kapseln begünstigt.
Es scheint möglich, die probiotischen Keime in Fleischerzeugnissen einzusetzen.
Schutzeffekte durch die Mikroverkapselung waren ansatzweise erkennbar. Diese
sind jedoch für die individuelle Anwendung, d. h. für jeden Stamm und Zusatz,
spezifisch zu untersuchen. Es kann folglich keine allgemeine Empfehlung für die
Mikroverkapselung probiotischer Bakterien und deren Einsatz in Fleischerzeugnissen
gegeben werden.

8 Summary
Julia Nina Jähne
Summary
Development of microencapsulated probiotic preparations for use as additives
in meat products
The aim of this study was to develop technological and microbiological basics for use
of microencapsulated probiotics in meat products. The suitability of four different
probiotic strains Lactobacillus reuteri (S 24), Lactobacillus rhamnosus (S 25),
Lactobacillus paracasei (S 26) and Lactobacillus gasseri (S 28), for potential use as
additives in meat products was tested. The effect of different spices and
concentrations of NaCl was investigated as well as different microencapsulations and
storage temperatures.
In preliminary tests the effect of twelve different spices and three concentrations of
NaCl was investigated. The effect of cloves, black pepper, garlic, oregano, ginger,
mustard, basil, rose-paprika, sweet paprika, majoram, bulb and caraway was tested.
NaCl was added in concentrations of 1 %, 2 % and 5 %, respectively. The additives
with the greatest effects, 5 % NaCl, 10 % cloves and 10 % black pepper, were
chosen for storage trial.
The lactobacilli were lyophilised in a first step and microencapsulated in a second
step. Each strain was microencapsulated in two different ways: water-soluble with a
maltodextrine coating and water-insoluble with a fat coating. Both coatings were
produced in three different formulations: 10 %, 30 % and 50 % capsule part.
These microencapsulated samples were stored at 2 °C and 20 °C for six months in
four different gelatine solutions: 1. without additives, 2. with 5 % NaCl, 3. with 10 %
cloves and 4. with 10 % black pepper. The lyophilised non coated samples were also
stored at both temperatures for six months.
157

158
Summary
At the beginning of the trial and after that every four weeks the bacterial count of all
samples was determined on MRS-agar.
During the storage period of six months the lyophilised probiotic strains Lactobacillus
reuteri (S 24), Lactobacillus rhamnosus (S 25), Lactobacillus paracasei (S 26) and
Lactobacillus gasseri (S 28) showed to be very stable at 2 °C and relatively stable at
20 °C.
The conditions of microencapsulation and storage influenced the four probiotic
lactobacilli strains individually different. Protective effects of the microencapsulation
were recognised in some cases. Although at the beginning protective effects against
the strong antimicrobial effects of cloves were shown for Lactobacillus rhamnosus
(S 25), none of the tested coatings was able to protect durably. In most cases thickwalled
capsules protected better than thin-walled ones. Lactobacillus reuteri (S 24)
and Lactobacillus gasseri (S 28) showed better growth at 20 °C. Lactobacillus
rhamnosus (S 25) proved to be very stable. The growth of Lactobacillus paracasei
(S 26) was promoted by cooled storage and water-soluble, thick-walled capsules.
The use of the tested probiotic strains in meat products seems possible as protective
effects of the microencapsulation were recognised for specific combinations. These
effects must be tested for each specific application, e. g. strain/additive combination,
due to individual differences. Therefore, a general reference for the
microencapsulation of probiotic bacteria and their use in meat products cannot be
given.

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ZITTERMANN, A. (1994):
Antioxidative und prooxidative Lebensmittelinhaltsstoffe.
Dtsch. Apoth. Ztg. 134, 2991
187

10 Anhang
10.1 Ergebnistabellen
Anhang
Tabelle 24: Keimzahlen (Kz in lg KbE/g) der Lyophilisate von L. reuteri (S 24),
Code
2 °C
20 °C
Proben-Nr.
L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28),
Verlaufsübersicht
U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1
Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆ Kz
97 (S 24) 7,52 7,72 7,76 5,76 6,20 6,26 6,18 -1,34
98 (S 25) 10,11 9,85 9,30 8,98 9,41 9,26 9,28 -0,83
99 (S 26) 10,11 9,38 9,30 10,11 9,51 9,28 9,72 -0,39
100 (S 28) 7,30 8,38 8,04 7,30 7,64 8,46 7,74 0,44
197 (S 24) 7,52 6,57 5,46 5,20 3,99 3,83 2,30 -5,22
198 (S 25) 10,11 9,94 8,98 9,34 9,15 8,65 7,73 -2,38
199 (S 26) 10,11 9,67 9,67 8,65 8,20 5,38 3,11 -7,00
200 (S 28) 7,30 8,00 7,81 6,83 4,95 4,43 3,88 -3,42
U = Untersuchungszeitpunkte in 4-wöchigem Abstand (siehe Tab. 19), Lagerung bei 2 °C: Nr. 97-100,
Lagerung bei 20 °C: Nr. 197-200, S 24: L. reuteri, S 25: L. rhamnosus, S 26: L. paracasei,
S 28: L. gasseri
___ = nicht methodenunabhängig, d. h. |∆ Kz| < 0,70 lg KbE/g
189

Code
wasserlösliches Coating, 2 °C
wasserunlösliches Coating, 2 °C
190
Anhang
Tabelle 25: Keimzahlen (Kz in lg KbE/ml) von L. reuteri (S 24),
Verlaufsübersicht
Proben
U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1
-Nr. Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆ Kz
1 6,23 5,88 4,45 5,23 4,40 3,48 3,99 -2,24
2 5,04 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -3,04
3 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
4 7,48 6,85 6,83 4,99 4,71 3,89 4,18 -3,30
5 6,72 3,76 5,46 4,15 3,63 4,43 3,20 -3,52
6 3,99 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -1,99
7 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
8 7,08 5,70 5,93 5,65 4,73 4,94 3,53 -3,55
9 5,51 3,99 3,84 2,60 3,20 3,98 3,85 -1,66
10 2,91 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -0,91
11 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
12 6,30 5,26 4,94 6,32 3,71 3,34 3,34 -2,96
49 6,63 5,52 3,59 2,48 2,30 2,00 2,00 -4,63
50 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
51 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
52 7,58 5,69 5,79 5,30 2,00 2,00 2,00 -5,58
53 5,90 4,36 4,51 2,78 2,00 2,00 2,00 -3,90
54 3,40 4,18 2,56 2,00 2,00 2,00 2,00 -1,40
55 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
56 6,34 6,11 5,61 5,08 5,04 3,77 3,11 -3,23
57 5,53 4,91 3,57 3,11 2,70 2,00 2,00 -3,53
58 2,30 2,30 2,30 2,00 2,00 2,00 2,00 -0,30
59 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
60 6,48 5,64 5,59 5,45 3,28 4,00 3,43 -3,05

Code
wasserlösliches Coating, 20 °C
wasserunlösliches Coating, 20 °C
Anhang
Proben
U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1
-Nr. Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆ Kz
101 6,23 8,65 8,20 6,83 6,38 5,82 6,00 -0,23
102 5,04 6,90 6,08 5,45 6,11 6,11 6,04 1,00
103 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
104 7,48 7,87 7,41 5,43 5,85 5,79 6,00 -1,48
105 6,72 8,23 7,15 7,08 6,73 6,71 5,83 -0,89
106 3,99 4,30 4,30 6,30 5,98 5,08 5,92 1,93
107 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
108 7,08 6,30 7,38 6,53 6,96 6,48 5,94 -1,14
109 5,51 4,30 3,30 6,28 6,08 5,15 5,95 0,44
110 2,91 3,30 3,30 4,23 4,46 4,41 4,45 1,54
111 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
112 6,30 8,20 7,08 6,36 6,69 5,90 6,74 0,44
149 6,63 8,00 7,41 6,95 6,62 7,11 7,04 0,41
150 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
151 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
152 7,58 7,61 7,56 6,51 6,45 3,70 2,00 -5,58
153 5,90 7,26 6,90 6,40 6,54 6,26 6,04 0,14
154 3,40 3,30 3,30 4,43 4,36 3,89 4,40 1,00
155 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
156 6,34 8,40 7,04 5,81 5,92 5,32 2,00 -4,34
157 5,53 6,76 6,96 6,88 6,82 6,62 6,11 0,58
158 2,30 2,90 2,30 3,91 3,88 3,73 3,97 1,67
159 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
160 6,48 7,08 6,99 6,94 6,53 5,73 2,00 -4,48
U = Untersuchungszeitpunkte in 4-wöchigem Abstand (siehe Tab. 19), 10 % Coating: Nr. 1-4, 49-52,
101-104, 149-152, 30 % Coating: Nr. 5-8, 53-56, 105-108, 153-158, 50 % Coating: Nr. 9-12, 57-60,
109-112, 157-160, Ohne Zusätze: Nr. 1, 5, 9, 49, 53, 57, 101, 105, 109, 149, 153, 157, Zusatz NaCl:
Nr. 2, 6, 10, 50, 54, 58, 102, 106, 110, 150, 154, 158, Zusatz Nelken: Nr. 3, 7, 11, 51, 55, 59, 103,
107, 111, 151, 155, 159, Zusatz Schwarzer Pfeffer: Nr. 4, 8, 12, 52, 56, 60, 104, 108, 112, 152, 156,
160
___ = nicht methodenunabhängig, d. h. |∆ Kz| < 0,70 lg KbE/ml, ___ = ∆ Kz = 0 lg KbE/ml
191

192
Anhang
Tabelle 26: Keimzahlen (Kz in lg KbE/ml) von L. rhamnosus (S 25),
Code
wasserlösliches Coating, 2 °C
wasserunlösliches Coating, 2 °C
Verlaufsübersicht
Proben
U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1
-Nr. Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆ Kz
13 8,26 7,93 8,04 7,85 7,28 5,85 7,28 -0,98
14 7,78 5,00 7,63 5,79 5,82 5,72 5,53 -2,25
15 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
16 7,54 7,38 6,95 7,08 6,98 6,82 6,91 -0,63
17 8,20 7,73 7,54 7,59 7,73 6,51 6,86 -1,34
18 7,69 7,41 7,41 6,76 6,79 6,85 6,76 -0,93
19 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
20 7,89 7,40 7,18 6,89 6,61 6,78 6,64 -1,25
21 8,26 7,76 7,88 6,08 6,58 6,69 6,92 -1,34
22 7,20 6,45 7,00 6,72 6,58 6,73 6,83 -0,37
23 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
24 7,80 7,30 7,46 6,58 6,60 6,88 6,62 -1,18
61 8,04 7,67 7,11 6,91 6,96 6,81 7,04 -1,00
62 8,00 7,90 7,68 6,91 6,20 6,69 6,86 -1,14
63 3,58 2,30 2,48 2,00 2,00 2,00 2,00 -1,58
64 7,32 7,83 7,70 8,40 6,83 6,79 6,51 -0,81
65 7,63 7,56 7,67 7,60 7,88 6,67 6,66 -0,97
66 8,00 7,52 7,94 4,52 6,81 6,75 6,81 -1,19
67 2,60 2,30 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -0,60
68 7,97 7,45 7,67 8,00 8,04 7,32 6,95 -1,02
69 7,58 7,70 7,46 7,34 7,88 6,63 6,74 -0,84
70 7,64 7,18 7,36 6,73 6,69 6,63 6,79 -0,85
71 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
72 7,67 7,53 7,97 6,46 7,77 7,45 7,88 0,21

Code
wasserlösliches Coating, 20 °C
wasserunlösliches Coating, 20 °C
Anhang
Proben
U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1
-Nr. Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆ Kz
113 8,26 8,40 6,70 7,00 6,63 6,23 5,90 -2,36
114 7,78 8,00 7,34 7,18 6,11 5,92 6,08 -1,70
115 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
116 7,54 7,88 7,84 6,97 6,82 6,74 6,04 -1,50
117 8,20 7,52 7,74 7,23 6,65 6,76 6,41 -1,79
118 7,69 7,11 7,08 6,86 6,73 6,93 6,95 -0,74
119 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
120 7,89 7,23 6,98 6,89 5,76 5,57 5,94 -1,95
121 8,26 8,08 8,04 7,63 7,32 6,51 6,71 -1,55
122 7,20 6,85 7,20 7,15 6,72 6,61 7,30 0,10
123 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
124 7,80 9,48 7,83 6,83 6,80 6,49 6,18 -1,62
161 8,04 8,68 8,23 7,11 7,20 6,74 6,99 -1,05
162 8,00 7,72 7,45 6,95 7,04 4,53 4,00 -4,00
163 3,58 2,95 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -1,58
164 7,32 8,46 8,04 7,91 6,63 6,20 5,20 -2,12
165 7,63 7,63 8,78 7,75 7,86 7,65 6,30 -1,33
166 8,00 7,41 7,71 7,34 7,86 6,26 4,89 -3,11
167 2,60 3,20 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -0,60
168 7,97 8,70 7,20 7,58 6,76 6,08 5,36 -2,61
169 7,58 8,56 7,08 8,04 6,85 7,00 6,04 -1,54
170 7,64 7,04 7,20 6,94 7,23 6,86 6,54 -1,10
171 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
172 7,67 8,68 7,30 8,00 6,23 6,88 6,58 -1,09
U = Untersuchungszeitpunkte in 4-wöchigem Abstand (siehe Tab. 19), 10 % Coating: Nr. 13-16,
61-64, 113-116, 161-164, 30 % Coating: Nr. 17-20, 65-68, 117-120, 165-168, 50 % Coating:
Nr. 21-24, 69-72, 121-124, 169-172, Ohne Zusätze: Nr. 13, 17, 21, 61, 65, 69, 113, 117, 121, 161,
165, 169, Zusatz NaCl: Nr. 14, 18, 22, 62, 66, 70, 114, 118, 122, 162, 166, 170, Zusatz Nelken:
Nr. 15, 19, 23, 63, 67, 71, 115, 119, 123, 163, 167, 171, Zusatz Schwarzer Pfeffer: Nr. 16, 20, 24, 64,
68, 72, 116, 120, 124, 164, 168, 172
___ = nicht methodenunabhängig, d. h. |∆ Kz| < 0,70 lg KbE/ml, ___ = ∆ Kz = 0 lg KbE/ml
193

194
Anhang
Tabelle 27: Keimzahlen (Kz in lg KbE/ml) von L. paracasei (S 26),
Code
wasserlösliches Coating, 2 °C
wasserunlösliches Coating, 2 °C
Verlaufsübersicht
Proben
U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1
-Nr.: Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆Kz
25 7,65 8,63 8,04 8,08 7,72 7,91 8,40 0,75
26 5,97 6,36 6,59 6,38 4,89 5,04 4,92 -1,05
27 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
28 8,15 7,75 7,76 7,41 7,18 7,30 7,04 -1,11
29 7,46 7,36 7,92 7,20 6,93 7,15 7,30 -0,16
30 4,81 5,00 5,04 4,89 5,04 4,71 4,95 0,14
31 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
32 7,23 8,18 7,94 7,81 6,98 7,04 6,56 -0,67
33 7,62 7,20 9,23 6,62 6,41 6,65 6,97 -0,65
34 3,75 4,90 3,74 5,23 4,71 3,61 4,08 0,33
35 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
36 7,59 7,78 7,61 7,61 6,99 6,65 6,76 -0,83
73 6,65 5,30 6,65 5,30 6,30 6,11 6,41 -0,24
74 5,88 5,08 6,23 5,04 5,32 4,76 5,41 -0,47
75 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
76 7,81 7,62 7,76 7,88 7,08 7,20 7,15 -0,66
77 6,76 6,49 6,79 6,86 6,67 6,59 6,57 -0,19
78 5,86 4,85 5,26 5,68 6,43 5,65 3,79 -2,07
79 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
80 7,81 7,60 7,57 7,81 7,83 7,34 6,79 -1,02
81 6,46 6,38 7,89 6,65 6,45 6,38 5,65 -0,81
82 5,04 4,15 4,57 4,30 3,92 3,63 3,53 -1,51
83 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
84 8,15 7,60 8,11 7,98 7,96 7,85 7,18 -0,97

Code
wasserlösliches Coating, 20 °C
wasserunlösliches Coating, 20 °C
Anhang
Proben
U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1
-Nr.: Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆Kz
125 7,65 9,08 7,38 6,68 7,26 4,80 5,00 -2,65
126 5,97 6,94 3,32 4,43 4,48 4,36 4,36 -1,61
127 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
128 8,15 8,43 6,60 6,65 6,00 3,91 2,00 -6,15
129 7,46 8,83 6,76 6,89 5,79 4,81 2,00 -5,46
130 4,81 6,49 3,56 4,41 4,34 4,30 4,28 -0,53
131 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
132 7,23 8,52 6,62 6,60 6,04 3,81 2,70 -4,53
133 7,62 8,64 7,85 7,30 5,52 3,52 4,08 -3,54
134 3,75 6,95 6,81 5,69 6,04 3,81 4,18 0,43
135 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
136 7,59 8,51 6,98 6,61 6,08 3,71 2,00 -5,59
173 6,65 6,51 6,78 6,18 5,41 5,97 3,26 -3,39
174 5,88 6,20 6,00 5,40 6,57 5,48 5,95 0,07
175 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
176 7,81 8,82 7,63 7,72 6,51 5,30 2,00 -5,81
177 6,76 8,48 6,51 6,72 6,51 6,40 3,52 -3,24
178 5,86 8,40 6,38 5,59 5,23 5,93 4,59 -1,27
179 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
180 7,81 8,88 7,69 7,74 5,54 5,45 2,00 -5,81
181 6,46 8,60 7,54 7,92 5,61 5,88 4,18 -2,28
182 5,04 3,30 3,30 4,41 4,45 4,34 4,48 -0,56
183 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
184 8,15 8,36 8,10 7,53 5,81 5,98 2,00 -6,15
U = Untersuchungszeitpunkte in 4-wöchigem Abstand (siehe Tab. 19), 10 % Coating: Nr. 25-28,
73-76, 125-128, 173-176, 30 % Coating: Nr. 29-32, 77-80, 129-132, 177-180, 50 % Coating:
Nr. 33-36, 81-84, 133-136, 181-184, Ohne Zusätze: Nr. 25, 29, 33, 73, 77, 81, 125, 129, 133, 173,
177, 181, Zusatz NaCl: Nr. 26, 30, 34, 74, 78, 82, 126, 130, 134, 174, 178, 182, Zusatz Nelken:
Nr. 27, 31, 35, 75, 79, 83 127, 131, 135, 175, 179, 183, Zusatz Schwarzer Pfeffer: Nr. 28, 32, 36, 76,
80, 84, 128, 132, 136, 176, 180, 184
___ = nicht methodenunabhängig, d. h. |∆ Kz| < 0,70 lg KbE/ml, ___ = ∆ Kz = 0 lg KbE/ml
195

196
Anhang
Tabelle 28: Keimzahlen (Kz in lg KbE/ml) von L. gasseri (S 28),
Code
wasserlösliches Coating, 2 °C
wasserunlösliches Coating, 2 °C
Verlaufsübersicht
Proben U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1
-Nr.: Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆Kz
37 7,38 6,40 6,00 4,93 3,67 2,95 2,90 -4,48
38 5,98 2,78 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -3,98
39 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
40 7,34 7,08 6,90 6,56 6,26 6,54 4,83 -2,51
41 6,76 6,59 5,78 4,51 4,99 3,92 2,90 -3,86
42 6,89 2,30 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -4,89
43 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
44 6,70 6,43 6,08 5,92 5,90 5,80 5,66 -1,04
45 7,08 6,30 5,89 4,68 4,79 3,75 2,85 -4,23
46 6,26 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -4,26
47 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
48 6,96 5,86 6,08 6,32 6,34 5,76 5,79 -1,17
85 5,30 5,38 4,89 3,54 2,90 2,95 2,00 -3,30
86 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
87 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
88 7,71 6,96 6,93 6,18 6,43 6,32 4,90 -2,81
89 6,49 5,48 6,00 3,57 3,38 2,98 2,00 -4,49
90 6,78 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 -4,78
91 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
92 6,83 6,84 6,74 6,57 5,15 5,15 4,69 -2,14
93 3,58 5,54 4,66 3,56 3,78 3,18 2,00 -1,58
94 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
95 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
96 7,20 6,70 6,54 6,48 6,79 6,57 4,61 -2,59

Code
wasserlösliches Coating, 20 °C
wasserunlösliches Coating, 20 °C
Anhang
Proben U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U7-U1
-Nr.: Kz Kz Kz Kz Kz Kz Kz ∆Kz
137 7,38 6,54 7,15 7,23 6,98 6,56 5,71 -1,67
138 5,98 5,30 5,94 5,87 2,30 3,83 4,30 -1,68
139 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
140 7,34 8,08 7,83 6,52 6,51 5,38 3,00 -4,34
141 6,76 8,26 7,04 7,18 6,98 5,81 5,04 -1,72
142 6,89 6,45 6,46 6,61 5,45 6,51 5,77 -1,12
143 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
144 6,70 7,98 5,30 6,61 5,90 5,98 3,26 -3,44
145 7,08 8,15 7,38 7,08 6,90 6,43 6,11 -0,97
146 6,26 7,04 6,53 6,46 6,76 5,40 5,04 -1,22
147 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
148 6,96 7,73 7,00 6,93 6,62 6,30 5,65 -1,31
185 5,30 7,38 7,04 6,76 5,85 5,98 5,98 0,68
186 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
187 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
188 7,71 7,56 6,45 6,26 6,46 6,23 3,18 -4,53
189 6,49 7,65 7,93 7,64 7,86 6,40 6,92 0,43
190 6,78 7,04 7,11 7,43 6,72 6,57 6,95 0,17
191 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
192 6,83 8,11 6,40 6,11 5,94 5,48 2,00 -4,83
193 3,58 7,36 7,11 7,28 7,18 7,18 6,41 2,83
194 2,00 2,00 2,00 2,00 0,70 0,70 0,70 0,00
195 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 0,00
196 7,20 7,95 7,52 7,38 5,74 5,68 5,45 -1,75
U = Untersuchungszeitpunkte in 4-wöchigem Abstand (siehe Tab. 19), 10 % Coating: Nr. 37-40,
85-88, 137-140, 185-188, 30 % Coating: Nr. 41-44, 89-92, 141-144, 189-192, 50 % Coating:
Nr. 45-48, 93-96, 145-148, 193-196, Ohne Zusätze: Nr. 37, 41, 45, 85, 89, 93, 137, 141, 145, 185,
189, 193, Zusatz NaCl: Nr. 38, 42, 46, 86, 90, 94, 138, 142, 146, 186, 190, 194, Zusatz Nelken:
Nr. 39, 43, 47, 87, 91, 95, 139, 143, 147, 187, 191, 195, Zusatz Schwarzer Pfeffer: Nr. 40, 44, 48, 88,
92, 96, 140, 144, 148, 188, 192, 196
___ = nicht methodenunabhängig, d. h. |∆ Kz| < 0,70 lg KbE/ml, ___ = ∆ Kz = 0 lg KbE/ml
197

10.2 Nährmedien
10.2.1 Nährmedien für Laktobazillen
MRS-Bouillon
198
Anhang
CM 359, Oxoid, Wesel, Deutschland
(Lactobacillus-Bouillon nach de Man, Rogosa und Sharp)
Typische Zusammensetzung g/l
Pepton 10,0
Fleischextrakt ‚Lab-Lemco’ 8,0
Hefeextrakt 4,0
Glukose 20,0
‚Tween’ 80 1 ml
Dikaliumhydrogenphosphat 2,0
Natriumacetat 5,0
Triammoniumcitrat 2,0
Magnesiumsulfat 0,2
Mangan(II)-sulfat 0,05
pH 6,2 ± 0,2
52 g MRS-Bouillon in 1 l Aqua dest. unter Rühren bei 60 °C bis zum vollständigen
Lösen erhitzen. Abfüllen der MRS-Bouillon zu 10 ml in Reagenzgläser. 15 Minuten
bei 121 °C autoklavieren.
MRS-Nährboden
CM 361, Oxoid, Wesel, Deutschland
(Lactobacillus-Agar nach de Man, Rogosa und Sharpe)

Typische Zusammensetzung g/l
Anhang
Pepton 10,0
Fleischextrakt ‚Lab-Lemco’ 8,0
Hefeextrakt 4,0
Glukose 20,0
‚Tween’ 80 1 ml
Dikaliumhydrogenphosphat 2,0
Natriumacetat 5,0
Triammoniumcitrat 2,0
Magnesiumsulfat 0,2
Mangan(II)-sulfat 0,05
Agar
pH 6,2 ± 0,2
10,0
62 g MRS-Nährboden in 1 l Aqua dest. suspendieren und bis zum vollständigen
Lösen erhitzen. 15 Minuten bei 121 °C autoklavieren.
Agar-Nr. 1, neutral (Bakteriologischer Agar)
LP 11, Oxoid, Wesel, Deutschland
Typische Analyse
Feuchtigkeitsgehalt 7 %
Asche 2,0 %
Säureunlösliche Asche

200
Anhang
10.2.2 Weitere Nährmedien für die Untersuchung der Gewürze
CASO-Agar
105458, Merck, Darmstadt, Deutschland
(Caseinpepton-Sojamehlpepton-Agar)
40 g in 1 l Aqua dest. lösen durch Erhitzen im siedenden Wasserbad oder
strömenden Dampf. 15 Minuten bei 121 °C autoklavieren. pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C
RAMBACH ® -Agar
107500, Merck, Darmstadt, Deutschland
1 Flasche Supplement in 250 ml oder 1000 ml (je nach Packungsgröße) Aqua dest.
einmischen und gut umschwenken bis zur vollständigen Verteilung. 1 Flasche
Nährbodenpulver in das Ansatzgefäß geben, gut umschwenken, bis der Nährboden
vollständig suspendiert ist. Anschließend wird das Ansatzgefäß in ein kochendes
Wasserbad oder einen Dampftopf überführt und unter häufigem Umschwenken
gekocht. Der Nährboden darf keiner weiteren Hitze ausgesetzt werden! Der
Nährboden darf nicht autoklaviert werden! pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C
Salmonella-Anreicherungsbouillon nach RAPPAPORT zur selektiven
Anreicherung von Salmonella
110236, Merck, Darmstadt, Deutschland
54 g in 1 l Aqua dest. lösen, in Röhrchen abfüllen, schonend autoklavieren
(20 Minuten bei 115 °C). Bei längerer Aufbewahrung des zubereiteten Nährbodens
können Niederschläge auftreten, die die Wirksamkeit jedoch nicht beeinträchtigen.
pH 6,0 bei 25 °C
Standard I-Nähragar
107881, Merck, Darmstadt, Deutschland
37 g in 1 l Aqua dest. lösen durch Erhitzen im siedenden Wasserbad oder
strömenden Dampf. 15 Minuten bei 121 °C autoklavieren. pH 7,5 ± 0,2 bei 25 °C

TBG-Bouillon, modifiziert
Anhang
105178, Merck, Darmstadt, Deutschland
(Tetrathionat-Brilliantgrün-Galle-Anreicherungsbouillon)
63 g/l Aqua dest. lösen, nötigenfalls unter kurzem Erwärmen auf max. 50 °C; bei
Abfüllen das ungelöste Calciumcarbonat gleichmäßig verteilen. Nicht autoklavieren!
pH auf 7,0 ± 0,2 einstellen.
TSC-Agar
111972, Merck, Darmstadt, Deutschland
(Tryptose-Sulfit-Cycloserin-Agar)
42 g in 1 l Aqua dest. lösen durch Erhitzen im siedenden Wasserbad oder
strömenden Dampf. 15 Minuten bei 121 °C autoklavieren. Bei 50 bis 45 °C 0,5 g/l
Cycloserin (TSC-Agar) oder 3 mg/l Polymyxinsulfat und 12 mg/l Kanamycinsulfat
(SFP-Agar) als sterilfiltrierte Lösungen einmischen. pH 7,4 ± 0,2 bei 25 °C
Cycloserin pharm (17685, Serva Feinbiochemica, Heidelberg, Deutschland)
VRBD-Agar
110275, Merck, Darmstadt, Deutschland
(Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Glucose-Agar nach MOSSEL)
39,5 g in 1 l Aqua dest. lösen und im siedenden Wasserbad oder strömenden Dampf
unter regelmäßigem Umschwenken solange kochen bis der Nährboden vollständig
gelöst ist. Anschließend nicht länger als 2 Minuten weiterkochen. Nicht autoklavieren!
Nicht überhitzen. pH 7,3 ± 0,2 bei 25 °C
XLD-Agar
105287, Merck, Darmstadt, Deutschland
55 g in 1 l Aqua dest. vollständig lösen. Nicht autoklavieren. Gelegentliche
Ausfällungen beeinträchtigen nicht die Leistungsfähigkeit des Nährbodens.
pH 7,4 ± 0,2 bei 25 °C
201

YGC-Agar
202
Anhang
116000, Merck, Darmstadt, Deutschland
(Hefeextrakt-Glucose-Chloramphenicol-Agar FIL-IDF)
40 g in 1 l Aqua dest. lösen durch Erhitzen im siedenden Wasserbad oder
strömenden Dampf. 15 Minuten bei 121 °C autoklavieren. pH 6,6 ± 0,2 bei 25 °C
10.3 Technische Geräte und Verbrauchsmaterialien
Abwägeschiffchen Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe,
Deutschland
Anaerobiertopf, 2,5 l Oxoid, Wesel, Deutschland
AnaeroGen Oxoid, Wesel, Deutschland
Autoklav Webeco, Bad Schwartau, Deutschland
Brutschrank, 30 °C Memmert, Schwabach, Deutschland
Brutschrank, 37 °C Memmert, Schwabach, Deutschland
Brutschrank, 42 °C Memmert, Schwabach, Deutschland
CO2-Brutschrank, CB 210 Binder GmbH, Tuttlingen, Deutschland
Crystal Violet Concentrate Viva Diagnostika, Diagnostische
Produkte GmbH, Köln, Deutschland
Dampftopf Nr. 920909 Fritz Gössner GmbH & Co., Hamburg,
Deutschland

Anhang
Dilute Carbol Fuchsin Concentrate Viva Diagnostika, Diagnostische
Produkte GmbH, Köln, Deutschland
Dispensor, Fortuna ® , Optimat ® 2,
Nr. 4000974600501
OMNILAB, Bremen, Deutschland
Gefriertruhe -80 °C, Typ 6385 GFL – Gesellschaft für Labortechnik
mbH, Burgwedel, Deutschland
Glaskolben, 500 ml Schott Duran GmbH, Wertheim/Main,
Deutschland
Kapsenberg-Kappen Schott Duran GmbH, Wertheim/Main,
Deutschland
Kohlendioxid Linde AG, Wiesbaden, Deutschland
Kühlkammer Stibbe, Wunstorf, Deutschland
Kühlschrank Liebherr, Ochsenhausen, Deutschland
Lugol’s Iodine Concentrate Viva Diagnostika, Diagnostische
Produkte GmbH, Köln, Deutschland
Magnetrührer C. Gerhardt GmbH & Co. KG,
Königswinter, Deutschland
Microbank ® , 22 V 160 MO Viva Diagnostika, Diagnostische
Produkte GmbH, Köln, Deutschland
Mikroliter-Pipette, Reference ® ,
1 - 100 µl
Mikroliter-Pipette, Reference ® ,
1 - 1000 µl
Eppendorf GmbH, Hamburg,
Deutschland
Eppendorf GmbH, Hamburg,
Deutschland
203

204
Anhang
Mikroskop Axiolab Carl Zaiss AG, Oberkochen,
Deutschland
Petrischalen, 90Ø ohne Nocken,
10-00218
Ronnenberger Laborbedarf,
Ronnenberg, Deutschland
pH-Meter, Nr. 38900138 WTW GmbH, Weilheim, Deutschland
Pipettenspitzen 1000 µl Ratiolab GmbH, Dreieich, Deutschland
Pipettenspitzen 300 µl Eppendorf GmbH, Hamburg,
Deutschland
Reagenzgläser Schott Duran GmbH, Wertheim/Main,
Deutschland
Röhren aus Polypropylen mit rundem
Boden und Schraubverschluss mit O-
Ring (autoklavierbar), 13 ml, farblos,
60.541.004 PP
Rondoflame, Fireboy eco TecNoMara
Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
Sauerstoff Linde AG, Wiesbaden, Deutschland
Schüttler Janke & Kunkel IKA ® -Werke GmbH &
Co. KG, Staufen, Deutschland
Sterilisator Memmert, Schwabach, Deutschland
Stickstoff Linde AG, Wiesbaden, Deutschland
Stomacher 400 Seward, London, UK

Anhang
Umkehr Osmose Anlage SG Kloos Laborbedarf, Langenhagen,
Deutschland
Waage 0,1 - 120 g Mettler-Toledo GmbH, Giessen,
Deutschland
Waage 1 - 2000 g Mettler-Toledo GmbH, Giessen,
Deutschland
Waage Oberschale, Typ MC1 Sartorius AG, Göttingen, Deutschland
Wasserbad Memmert, Schwabach, Deutschland
205

10.4 Abbildungsverzeichnis
206
Anhang
Abbildung 1: Morphologie mikroverkapselter Teilchen nach RUNGE (2001).... 60
Abbildung 2: Prinzipien Wirbelschicht-Coating (GLATT ® 2006)........................ 65
Abbildung 3: Prinzip Wirbelschicht-Coating im kontinuierlichen Glatt ® -Fließbett
Top-Spray (GLATT ® 2006)........................................................... 65
Abbildung 4: Prinzip Wirbelschicht-Coating im kontinuierlichen Glatt ® -Fließbett
Bottom-Spray (GLATT ® 2006) ..................................................... 66
Abbildung 5: L. reuteri (S 24) und L. rhamnosus (S 25): Isolierung, Kultivierung
und Sicherung der Stämme ......................................................... 80
Abbildung 6: L. paracasei (S 26): Isolierung, Kultivierung und Sicherung des
Stammes...................................................................................... 82
Abbildung 7: L. gasseri (S 28): Isolierung, Kultivierung und Sicherung des
Stammes...................................................................................... 84
Abbildung 8: Versuchsaufbau Vorversuche ...................................................... 89
Abbildung 9: Darstellung einer Wirbelschichtanlage GPCG (GLATT ® )............. 91
Abbildung 10: Prinzip Wirbelschicht-Coating im kontinuierlichen Glatt ® -Fließbett
Top-Spray (GLATT ® ).................................................................... 92
Abbildung 11: Keimzahlen der Lyophilisate von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus
(S 25), L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28), Verlaufsübersicht
................................................................................................... 112
Abbildung 12: Keimzahlen von L. reuteri (S 24) ohne den Einfluss von Zusätzen..
................................................................................................... 114
Abbildung 13: Keimzahlen von L. reuteri (S 24) unter dem Einfluss von NaCl . 115
Abbildung 14: Keimzahlen von L. reuteri (S 24) unter dem Einfluss von
Schwarzem Pfeffer..................................................................... 117
Abbildung 15: Keimzahlen von L. rhamnosus (S 25) ohne den Einfluss von
Zusätzen .................................................................................... 119
Abbildung 16: Keimzahlen von L. rhamnosus (S 25) unter dem Einfluss von NaCl
................................................................................................... 120

Anhang
Abbildung 17: Keimzahlen von L. rhamnosus (S 25) unter dem Einfluss von
Nelken........................................................................................ 121
Abbildung 18: Keimzahlen von L. rhamnosus (S 25) unter dem Einfluss von
Schwarzem Pfeffer..................................................................... 123
Abbildung 19: Keimzahlen von L. paracasei (S 26) ohne den Einfluss von
Zusätzen .................................................................................... 124
Abbildung 20: Keimzahlen von L. paracasei (S 26) unter dem Einfluss von NaCl ..
................................................................................................... 125
Abbildung 21: Keimzahlen von L. paracasei (S 26) unter dem Einfluss von
Schwarzem Pfeffer..................................................................... 127
Abbildung 22: Keimzahlen von L. gasseri (S 28) ohne den Einfluss von Zusätzen
................................................................................................... 128
Abbildung 23: Keimzahlen von L. gasseri (S 28) unter dem Einfluss von NaCl 129
Abbildung 24: Keimzahlen von L. gasseri (S 28) unter dem Einfluss von
Schwarzem Pfeffer..................................................................... 131
207

10.5 Tabellenverzeichnis
208
Anhang
Tabelle 1: Wichtige technologisch genutzte Genera und probiotisch eingesetzte
Spezies der Milchsäurebakterien (KLEIN 2001).................................. 21
Tabelle 2: Einteilung des Genus Lactobacillus in Subgenera (nicht mehr gültig)
bzw. in phänotypische/molekularbiologische Untergruppen (KLEIN
2001)................................................................................................... 24
Tabelle 3: L. acidophilus-Gruppe, Referenzen und Typstämme .......................... 26
Tabelle 4: L. casei-Gruppe, Referenzen und Typstämme.................................... 27
Tabelle 5: L. reuteri/L. fermentum-Gruppe, Referenzen und Typstämme............ 29
Tabelle 6: Gesicherte und mögliche Gesundheitseffekte von Pro- und Prebiotika
(DE VRESE u. SCHREZENMEIR 2000) ............................................. 31
Tabelle 7: Immunmodulatorische Effekte von Probiotika (DE VRESE u.
SCHREZENMEIR 2000)...................................................................... 34
Tabelle 8: Risikogruppen für biologische Arbeitsstoffe nach § 3 Biostoffverordnung
(ANONYM 1999) ................................................................................. 35
Tabelle 9: Risikogruppen der in Tab. 3 - 5 genannten Laktobazillen nach
TRBA 466 (ANONYM 2006)................................................................ 37
Tabelle 10: Physiologische Kriterien von probiotischen Mikroorganismen, die einer
Unbedenklichkeitsprüfung bedürfen (ARBEITSGRUPPE
„PROBIOTISCHE MIKROORGANISMENKULTUREN IN
LEBENSMITTELN“ AM BUNDESINSTITUT FÜR
GESUNDHEITLICHEN VERBRAUCHERSCHUTZ UND
VETERINÄRMEDIZIN (jetzt: BfR) 2000) ............................................. 41
Tabelle 11: Häufig in der Fleischindustrie eingesetzte Starterkulturen (RUST
2004) ................................................................................................... 52
Tabelle 12: Verwendete Bakterienstämme ............................................................ 71
Tabelle 13: Zusammensetzung Lyophilisate, THT SA ........................................... 72
Tabelle 14: Musterübersicht der mikroverkapselten Bakterien, Micap ® GmbH...... 73
Tabelle 15: Nährmedienübersicht .......................................................................... 74

Anhang
Tabelle 16: Übersicht über die verwendeten Gewürze und deren Einsatz............. 78
Tabelle 17: Analysedaten der lyophilisierten Stämme, THT SA............................. 90
Tabelle 18: Probenschlüssel.................................................................................. 94
Tabelle 19: Untersuchungszeitpunkte.................................................................... 99
Tabelle 20: Keimzahlen (Kz) von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),
L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) unter dem Einfluss von
Gewürzen 1 - 6.................................................................................. 106
Tabelle 21: Keimzahlen (Kz) von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),
L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) unter dem Einfluss von
Gewürzen 7 - 12................................................................................ 107
Tabelle 22: Keimzahlen (Kz) von L. reuteri (S 24), L. rhamnosus (S 25),
L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28) unter dem Einfluss von
Kochsalz in verschiedenen Konzentrationen..................................... 109
Tabelle 23: Keimbelastung der Gewürze Nelken und Schwarzer Pfeffer............. 110
Tabelle 24: Keimzahlen (Kz in lg KbE/g) der Lyophilisate von L. reuteri (S 24),
L. rhamnosus (S 25), L. paracasei (S 26) und L. gasseri (S 28),
Verlaufsübersicht............................................................................... 189
Tabelle 25: Keimzahlen (Kz in lg KbE/ml) von L. reuteri (S 24), Verlaufsübersicht ...
...................................................................................................... 190
Tabelle 26: Keimzahlen (Kz in lg KbE/ml) von L. rhamnosus (S 25),
Verlaufsübersicht............................................................................... 192
Tabelle 27: Keimzahlen (Kz in lg KbE/ml) von L. paracasei (S 26), Verlaufsübersicht
...................................................................................................... 194
Tabelle 28: Keimzahlen (Kz in lg KbE/ml) von L. gasseri (S 28), Verlaufsübersicht ..
...................................................................................................... 196
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Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel
„Entwicklung von mikroverkapselten Probiotika-Präparaten zum Einsatz als
selbständig verfasst habe.
Zusatzstoff in Fleischerzeugnissen“
Bei der Anfertigung wurde keine Hilfe Dritter in Anspruch genommen.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten
(Promotionsberatern oder anderen Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat
von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die
im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation an folgender Institution angefertigt:
Institut für Lebensmittelqualität und -sicherheit
des Zentrums für Lebensmittelwissenschaften
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Bischofsholer Damm 15, D-30173 Hannover
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen
ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig
und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.
Julia Nina Jähne

Danksagung
Herrn Prof. Dr. Günter Klein danke ich für die Überlassung des Themas und die
Unterstützung und Betreuung bei der Anfertigung dieser Arbeit, sowie für die
Bereitstellung des Arbeitsplatzes.
Herrn PD Dr. Michael Kühne danke ich für die Überlassung des Themas dieser
Arbeit und die Unterstützung und Betreuung bei der Umsetzung. Trotz des Wechsels
seines Dienstortes nach Oldenburg war er bei Problemen und Schwierigkeiten immer
erreichbar.
Frau Dr. Christine Bonaparte danke ich herzlich für die hilfreiche und engagierte
Betreuung bei der Anfertigung dieser Arbeit. Während der Planung, im Labor, und
auch in der End- und Schreibphase gab sie mir immer wieder mit einem großen
Engagement wertvolle Ratschläge und Anregungen. Merci Christine.
Der Fritz-Ahrberg-Stiftung, Hannover danke ich für die finanzielle Förderung dieser
Arbeit.
Der Universität für Bodenkultur Wien, Department für Lebensmittelwissenschaften
und -technologie, Abteilung Lebensmittelmikrobiologie und -hygiene danke ich für die
Bereitstellung der Stämme S 24 und S 25.
Der Firma THT SA, Gembloux, Belgien danke ich für die Durchführung der
Lyophilisation. Besonders danke ich Herrn Eric De Mol. Merci Eric.
Der Firma Micap ® GmbH, Bremerhaven, speziell Herrn Jörg Rendel und Herrn
Andreas Bruns, danke ich für die Beratung hinsichtlich der Mikroverkapselung und
deren Durchführung.

Der GELITA ® AG, insbesondere Herrn Dr. Seybold und Herrn Dr. Ahlers, danke ich
für die freundliche Bereitstellung der Gelatine.
Der Firma Glatt ® GmbH danke ich für die freundliche Genehmigung die Abbildungen
Nr. 2, 3, 4, 9 und 10 dieser Arbeit veröffentlichen zu dürfen.
Ich danke meinen Kolleginnen und Kollegen des Institutes für Lebensmittelqualität
und -sicherheit für die angenehme und freundliche Arbeitsatmosphäre. Insbesondere
danke ich Frau Dr. Ute Körner für Ihre Unterstützung, sowie für die Antworten auf
viele Fragen und die angenehme, abwechslungsreiche (WG-)Büroatmosphäre, wofür
ich ebenfalls Frau Dr. Soumaya Lhafi und Herrn Sameh Abuseir danke. Frau Birte
Ahlfeld danke ich dafür, dass sie mir in labortechnischen und Laktobazillenspezifischen
Fragen immer gerne geholfen hat.
Bei meiner Familie, vor allem bei meinen Eltern und Großeltern, möchte ich mich
dafür bedanken, dass sie immer an mich geglaubt und mich unterstützt hat.
Helge, Dir danke ich für ALLES!!!

ISBN 978-3-939902-35-5
Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH
35392 Gießen · Frankfurter Str. 89 · Tel. 0641 / 24466 · Fax: 0641 / 25375
e-mail: Geschaeftsstelle@dvg.net · Homepage: http://www.dvg.net