Die Embryonalentwicklung der Paradiesschnecke ... - TOBIAS-lib

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Kapitel 5 Embryotests mit Marisa cornuarietis konnten zeigen, dass die Wirkung von Platin 2+ bei einer Temperaturerhöhung um 2 − 4 ◦ C deutlich schwächer ist, als bei der konventionell verwendeten Temperatur von 26 ◦ C. Bei leicht erhöhten Temperaturen traten Schnecken mit sogenannten „Teilschalen“ auf. Diese Teilschalen waren zum Teil internalisiert, also vom Mantel bedeckt, und zum Teil extern, also unbedeckt. Bei niedrigeren Platin 2+ -Konzentrationen im Testmedium konnten solche Teilschalen nicht beobachtet werden (Osterauer et al., 2010a). Um zu ermitteln, ob die beobachtete „Abschwächung“ der Platinwirkung bei erhöhten Temperaturen auf eine Induktion von Stressproteinen zurückzuführen ist, wurden Embryonen von Marisa cornuarietis bei 26 ◦ C und 29 ◦ C gegenüber Platin exponiert, der Gehalt an Hsp70 ermittelt und mit dem der jeweiligen Kontrollembryonen verglichen. Material und Methoden Um eine genügende Anzahl an Embryonen für die Stressproteinanalyse zu gewinnen, wurden für die beiden Kontrollen (bei 26 ◦ C bzw. 29 ◦ C) jeweils 4 Petrischalen mit Aquarienwasser gefüllt und je 25 frisch abgelegte Eier eingesetzt. Für die Platinexposition bei 29 ◦ C wurden 8 Petrischalen und für die Platinexposition bei 26 ◦ C 12 Petrischalen mit Platinchloridlösung (200 µL/L) gefüllt und jeweils 30 Eier eingesetzt. Die Petrischalen wurden bei den jeweiligen Temperaturen in Klimaschränken bei einem Hell-Dunkel- Rhythmus von 12:12 Stunden aufbewahrt. Nach 9 Tagen wurde die Embryonen mit Kanülen aus den Eihüllen entfernt und in mit Extratktionsgemisch aus 980 µl konzentriertem Extraktionspuffer gefüllte Reaktionsgefäße überführt (80mM Kaliumacetat, 5mM Magnesiumacetat, 20mM Hepes, aufgefüllt auf 500 ml mit Aqua bidest) + 20 µl Proteasehemmer, wobei 40 µl für die Kontrollen und 29 ◦ C Platin und 30 µl bei der 26 ◦ C Platin- Exposition verwendet wurden. Hierbei wurden die Embryonen gepoolt (26 ◦ C Kontrolle: 8 Embryonen, 26 ◦ C Platin: 30 Embryonen, 29 ◦ C Kontrolle: 8 Embryonen, 29 ◦ C Platin: 18 Embryonen). Die Embryonen wurden dann auf Eis mit einem Ultraschallgerät homogenisiert und das Homogenat danach 10 Minuten bei 4 ◦ C und 20000g abzentrifugiert. 130
Kapitel 5 Die Gesamtproteinmenge wurde nach Bradford (1976) ermittelt. Jeweils 40 µg Protein wurden auf ein Polyacrylamidgel gegeben und die Proteine elektrophoretisch aufgetrennt sowie auf Nitrocellulosemembranen transferiert. Im Anschluss wurden die Nitrocellulosemembranen mit dem ersten Antikörper (monoklonaler Maus anti-human Hsp70 Antikörper (1 µl Antikörperlösung, 0,5 ml Pferdeserum, 4,5 ml TBS)) inkubiert, gespült und mit einem zweiten, Peroxidase-konjugierten Antikörper inkubiert. Die Banden wurden durch eine Peroxidasefärbereaktion sichtbar gemacht und densitometrisch ausgewertet. Eine detaillierte Beschreibung der Stressproteinanalyse ist bei Osterauer et al. (2010a) zu finden. Ergebnisse Abb. 1 zeigt die relativen Hsp70-Level der Kontroll-Individuen bei 26 ◦ C und bei 29 ◦ C sowie der gegenüber Platin 2+ exponierten Embryonen bei ebenfalls 26 ◦ C und 29 ◦ C. Den höchsten Hsp70-Gehalt wiesen die Individuen mit interner Schale, bei 26 ◦ C gegenüber Platin 2+ exponierten Embryonen auf. Die Kontrollen bei 29 ◦ C zeigten den zweithöchsten Wert, gefolgt von den Kontrollen bei 26 ◦ C. Den niedrigsten Hsp70-Gehalt wiesen die bei 29 ◦ C gegenüber Platin 2+ exponierten Embryonen mit Teilschalen auf. Diskussion Bei 26 ◦ C führt eine Exposition gegenüber Platin 2+ bei Embryonen von Marisa cornuarietis zu einer deutlichen und starken Fehlbildung. Diese Tiere bilden keine äußere, sondern nur eine innere Schale (Osterauer et al., 2010b; Marschner et al., 2012). Exponiert man die Embryonen jedoch bei einer leicht erhöhten Temperatur, so wird die drastische Wirkung dieses Edelmetalls abgemildert und die Schnecken bilden eine Teilschale, d.h. sie entwickeln sich „normaler“ als bei niedrigeren Temperaturen unter Platin 2+ -Einfluss (Marschner et al., 2013). Die Analyse der jeweiligen Stressproteinlevels ergab jedoch, dass diese Embryonen nicht nur einen weitaus niedrigeren Hsp70- 131
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Material und Methoden Marisa cornua
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Ergebnisse lung von Marisa cornuari
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Ergebnisse Kapitel 3: Marschner, L.
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Ergebnisse Wachstum des Columellamu
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Diskussion Naticidae) entwickelt si
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Diskussion engrailed und dpp-BMP2/4
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Diskussion Abb. 4: Vergleich der mi
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Schlussfolgerung perimentell zu unt
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Literatur Engelhardt, W. (2008). Wa
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Literatur Ponder, W. F. und Lindber
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Kapitel 1:Turning snails into slugs
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Kapitel 1 dae). Their ontogeny also
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Kapitel 1 treatment 29.9 ± 32.78%
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Kapitel 1 Burnett, L.E., Woodson, P
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Kapitel 1 Page, L.R., 2002. Ontogen
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Kapitel 2: Arresting mantle formati
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Kapitel 2 cornuarietis (Mesogastrop
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