Die Embryonalentwicklung der Paradiesschnecke ... - TOBIAS-lib

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Zusammenfassung und wurden bei 20 ◦ C durchgeführt. Da bei P. corneus nur wenige Gelege gewonnen werden konnten, wurden nur wenige Replikate mit unterschiedlich vielen Eiern angesetzt. Die Auswertung fand in den folgenden Tagen statt, wobei für P. corneus nur das Merkmal Schalenbildung ausgewertet wurde. Diese Vorgehensweise wurde auch genutzt, um Embryonen für weitere Untersuchungen zu gewinnen, wobei die Embryonen in Abhängigkeit von der jeweiligen Fragestellung zu bestimmten Zeiten aus den Eiern entnommen oder die Eier bei höheren Temperaturen inkubiert wurden. Rasterelektronenmikroskopie Zu den jeweils geplanten Zeitpunkten wurden die Embryonen mit zwei Kanülen aus den Eihüllen entfernt und in zweiprozentiger Glutardialdehydlösung (gelöst in 0.01 M Cacodylat-Puffer) fixiert. Die Embryonen wurden dann in Cacodylat-Puffer gespült, über Nacht in einprozentiger reduzierter Osmiumtetroxidlösung fixiert und in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert. Die Schneckenembryonen wurden dann Kritisch-Punkt-getrocknet, auf Objekttische aufgeklebt und mit Gold besputtert. Die Untersuchung erfolgte in der Abteilung Evolutionsökologie der Invertebraten, Universität Tübingen (Prof. Dr. O. Betz) mit einem Rasterelektronenmikroskop. Histologie Für die histologischen Untersuchungen der Embryonen wurden diese mit zwei Kanülen entnommen und in Bouin’s Lösung oder in einer zweiprozentigen Glutardialdehydlösung (gelöst in 0.01 M Cacodylat-Puffer) fixiert. Danach wurden sie entweder in 70%igem Ethanol gewaschen und in einer aufsteigenden Ethanolreihe entwässert oder in Phosphatpuffer gespült und dann in der Ethanolreihe entwässert. Die Embryonen wurden in Technovit eingebettet, und es wurden Serienschnitte mit einem Mikrotom von 2-5 µm Dicke angefertigt. Die Schnitte wurden gefärbt (Hämatoxylin/Eosin- Färbung, Methylenblau-Färbung oder für Technovit angepasste Dreifachfärbung nach Mallory (Cason, 1950)) und mikroskopisch ausgewertet. Für die histologischen Untersuchungen von adulten Marisa cornuarietis wurden Embryonen neun Tagen lang gegenüber Platin exponiert und dann in Aquarienwasser transferiert und aufgezogen. Zusätzlich wurden Kontrol- 10
Material und Methoden lindividuen aufgezogen. Die adulten Schnecken wurden dann in einer zweiprozentigen Glutardialdehydlösung (gelöst in 0.01 M Cacodylat-Puffer) fixiert, in Cacodylat-Puffer gespült und in einem Ethanol-Ameisensäuregemisch entkalkt. Nach der Entwässerung in Ethanol wurden die Schnecken in Paraffin eingebettet. Mit einem Mikrotom (Leica SM 2000R) wurden Serienschnitte mit einer Dicke von 5 µm angefertigt und nach Cason (1950) gefärbt. Immunhistochemie Die Embryonen wurden mit zwei Kanülen aus den Eihüllen entfernt und mit Eppendorf-Pipetten in kleine Glaspetrischalen mit Mineralwasser (Römerquelle medium, Göppingen, Deutschland) gegeben. Nach 10-15 Minuten wurden sie in Eppendorfgefäße mit 4% Paraformaldehyd mit 0,1% Triton X transferiert. Die Embryonen wurden über Nacht bei 6 ◦ C fixiert und am nächsten Tag in Phosphatpuffer mit 0,1% Natriumazid gespült und 4 Stunden bei 6 ◦ C im Blockierpuffer inkubiert. Die folgende Inkubation mit dem ersten Antikörper (rabbit-anti-Serotonin, 1:200) dauerte 48, 72 oder 96 Stunden und wurde ebenfalls bei 6 ◦ C durchgeführt. Danach wurden die Proben in Phosphatpuffer mit 0,1% Natriumazid gespült und über 48, 72 oder 96 Stunden bei 6 ◦ C mit dem zweiten Antikörper inkubiert (Alexa 488-konjugierter goat-anti-rabbit, IgG, 1:200). Dieser Schritt fand wie alle folgenden Schritte im Dunkeln statt, um ein Ausbleichen des an den zweiten Antikörper konjugierten Fluoreszenzfarbstoffs Alexa 488 zu verhindern. Nach der Inkubation mit dem zweiten Antikörper wurden die Embryonen in Phosphatpuffer gespült und in einer Clearinglösung (ScaleB4, Hama et al., 2011) transparent gemacht. Dies fand bei Raumtemperatur statt. Die Embryonen wurden mit einem confokalen Laserscanningmikroskop untersucht und die gewonnenen Daten wurden mit FIJI-ImageJ visualisiert und analysiert. 3D-Rekonstruktionen Für die Rekonstruktionen wurden die Schnitte der adulten Schnecken fotografiert und mit dem 3D-Rekonstruktionsprogramm Amira (Visage Imaging) ausgewertet. Es wurden 3D-Modelle generiert. Da kleine und dünne Strukturen bei Computermodellierungen verloren gehen können, wurden die Modelle mit den Originalschnitten verglichen und in den Schnitten präsente, jedoch in den Modellen fehlende Strukturen wurden per 11
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