1+2/2006 - SpoleÄnost pro pojivové tkánÄ›
1+2/2006 - SpoleÄnost pro pojivové tkánÄ›
1+2/2006 - SpoleÄnost pro pojivové tkánÄ›
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
intenzivní, preparáty se znovu inkubují<br />
v pufru a přikrývají novým krycím sklem.<br />
Intenzita zbarvení závisí přímo úměrně<br />
na světelné expozici, Obyčejně lze udělat<br />
pouze 2–3 fotografie z jedné mitózy nebo<br />
jádra.<br />
Abychom zabránili vysušení preparátu,<br />
může se krycí sklo po okrajích zalít parafínem<br />
nebo Kronigovým cementem. Při použití<br />
olejové immerze nesmí přijít do styku<br />
olej s vodným barvícím roztokem.<br />
Lze zhotovovat i trvalé preparáty,<br />
které dehydratujeme alkoholem a zaléváme<br />
do media.<br />
Při barvení chinakrinem se sklíčko<br />
ponoří do roztoku pufru na 5 min., potom<br />
se preparáty dehydratují v 70 %, 96 %<br />
a 100 % alkoholu a nakonec se dají do xylénu<br />
a zalévají do neutrálního media (např.<br />
DPX). Tato metoda je více vhodná <strong>pro</strong> preparáty<br />
z interfázových jader, <strong>pro</strong>tože chromozómy<br />
ztrácejí obvykle tolik zbarvení, že<br />
<strong>pro</strong>užky již nejsou zřetelně patrné. Další<br />
zdokonalení <strong>pro</strong> obarvení interfázového<br />
jádra je dosaženo krátkou hydrolýzou v HCl<br />
(3N HCl při 22 °C po dobu 2 min.).<br />
U fluorescenčního barvení je možné<br />
přebarvování dalšími barvivy. Preparáty<br />
mohou být použity k přímému pozorování<br />
ve světelném mikroskopu po několika<br />
hodinách. Odstraníme krycí sklo (3 min,<br />
v 96 % alkoholu, který zároveň rozpouští<br />
fluorescenční barvivo bez poškození<br />
buněk). Po krátkém osušení na vzduchu je<br />
možné aplikovat, kteroukoliv barvící metodu<br />
(např. <strong>pro</strong> interfázická jádra Feulgenovo<br />
barvení). Naopak preparáty barvené některou<br />
ze standardních metod (Giemsa, eosin,<br />
orcein) mohou být odbarveny alkoholem<br />
(70 %) nebo kyselinou octovou (50 %)<br />
nebo oběma a potom obarveny chinakrinem.<br />
(Viz další podkapitola týkající se<br />
<strong>pro</strong>užkovacích metod na bázi denaturace<br />
a renaturace nukleových kyselin.<br />
3.l.12 Proužkovací techniky<br />
založené na bázi denaturace<br />
a renaturace nukleových<br />
kyselin<br />
Výklad denaturace a renaturace DNK<br />
(disociace a asociace) je nutný <strong>pro</strong> objasnění<br />
dalších <strong>pro</strong>užkovacích technik. Objev<br />
disociace a reasociace DNK přinesl nové<br />
informace o její struktuře.<br />
Šetrně izolovaná DNK tvoří tzv. dvojšroubovici,<br />
nativní molekulu. Ta může být<br />
rozpojena např. vysokými dávkami ultrazvuku<br />
nebo zahříváním v roztoku o nízké<br />
iontové síle. Za určitých podmínek mohou<br />
rozpojená vlákna reasociovat, tzn. tvoří stálé<br />
dvojšroubovicové molekuly, mající spirální<br />
strukturu, podobnou nativní DNK. Tyto<br />
<strong>pro</strong>cesy se označují termínem denaturace<br />
a renaturace, termín zavedl Britten (Britten<br />
1967–69). Bylo dále zjištěno, že vysoce<br />
repetitivní oblasti reasociují mnohem rychleji<br />
než ostatní oblasti DNK.<br />
U species Homo existuje individuální<br />
posloupnost nukleotidů i v těchto oblastech.<br />
Vysoce repetitivní oblastu asociují<br />
dokonce mnohokrát rychleji, než bakteriální<br />
DNK téže koncentrace. Tyto oblasti<br />
se vyskytují i v DNK vyšších organismů,<br />
včetně savců.<br />
Ze studia kinetiky reasociace DNK vyšších<br />
organismů vyplývá, že jde o řadu frakcí,<br />
lišících se rychlostí reasociace, kde hlavní<br />
z těchto frakcí je rychle asociující.<br />
Nejrychleji asociující je tzv. satelitní<br />
frakce DNK. Název není příliš šťastěně<br />
zvolen, neboť tato satelitní DNK nemá nic<br />
společného se satelity chromozómů (viz<br />
dále). V genomu myši existuje v podobě<br />
300 až 400 párů nukleotidů a tyto oblasti<br />
48<br />
LOCOMOTOR SYSTEM vol. 13, <strong>2006</strong>, No. <strong>1+2</strong>
Change language