HerdChek* BSE-Scrapie Antigen BOVINE SPONGIFORM ... - Defra

chaque puits de la microplaque, soit soumis à agitation douce, celle-ci peut ne pas être
visuellement perceptible. Le mouvement ne devra pas être trop vigoureux afin d’éviter toute
contamination inter-puits. Il en résulte une durée d’incubation raccourcie pour les étapes
respectives d’incubation des échantillons et du Conjugué comme détaillé dans le tableau
suivant. Le protocole “Ganglion Lymphatique et Rate de Petits Ruminants” ne requiert aucune
agitation lors des étapes d’incubation.
Les protocoles du test
Mode Opératoire
Protocole
Court
Protocole
Ultra-court
Ganglion
Lymphatique et Rate
de Petits Ruminants
Etape
1
2
3
4
5
6
Description
Distribution des
homogénats dans la
Plaque de dilution
Transfert des
échantillons dans la
Plaque de capture
Incubation des
échantillons
Lavage avec la Solution
1 de lavage (1x)
Tampon de
conditionnement:
Distribution / Incubation
Lavage avec la Solution
2 de lavage (x1)
7 Conjugué
8
Incubation du
Conjugué
18–26°C
à toutes les étapes
32–37°C 1 : à
toutes les étapes
d’incubation
(étapes 3, 5, 8 et 10)
18–26°C: toutes
les autres étapes y
compris les lavages
Tissue cérébral: 120 μl d’homogénat + 30 μl
de Diluant de la plaque de dilution.
18–26°C
à toutes les étapes
Ganglion lymphatique
et Rate de petits
ruminants: 100 μl
d’homogénat + 50 μl
de Diluant de la plaque
de dilution
BIEN HOMOGENEISER - Cf paragraphe “Dilution de
l’échantillon avec le Diluant de la plaque de dilution”.
Transférer l’échantillon dilué dans la Plaque de Capture
à raison de 100 µl/puits; homogénéiser les Contrôles, distribuer en
double à raison de 100 µl/puits;
couvrir la plaque à l’aide d’un couvercle.
45–60 min.:
sous agitation
200 ±100 rpm
20–25 min.:
sous agitation
200 ±100 rpm
2–3 heures – sans
agitation
Laver les puits 6 fois avec la Solution de lavage 1
à raison de 350 µl/puits.
Distribuer le Tampon de conditionnement à
raison de 100 µl/puits, couvrir la plaque et incuber
pendant 10 ±1 min.
Laver les puits 3 fois avec la Solution 2
de lavage (1x) à raison de 350 µl/puits.
Distribuer le conjugué dilué à raison de 100 µl/puits (CC pour
les échantillons de tissu cérébral de Bovins et ceux de ganglions
lymphatiques et de rate de petits ruminants; SRBCC pour les
échantillons de tissu cérébral de petits ruminants); couvrir la
plaque à l’aide d’un couvercle.
45–50 min. 25–30 min. 60–75 min.
9
10
11
Lavage avec la Solution
2 de lavage (x1)
Substrat: Distribution /
Incubation
Solution d’arrêt /
Lecture
Laver les puits 5 fois avec la Solution 2
de lavage (1x) à raison de 350 µl/puits.
Distribuer le Substrat à raison de 100 µl/puits, couvrir la plaque
et incuber 15±1 min. à l’abri de la lumière (ne pas utiliser de film
adhésif).
Distribuer la Solution d’arrêt à raison de 100 µl/puits; la plaque peut
rester jusqu’à 30 minutes dans l’obscurité avant lecture. La lecture
est faite en bi-chromatisme à 450/620 nm ou 450/650 nm.
1. Incubation entre 32 et 37 °C sous-entend placer la plaque de capture dans un incubateur préalablement porté à une
température comprise entre 32 et 37 °C.
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