HerdChek* BSE-Scrapie Antigen BOVINE SPONGIFORM ... - Defra

ligero horizontal y de forma circular. De esta manera la muestra tendrá un pequeño movimiento
en cada pocillo de la placa de microtitulación, aunque no llegue a apreciarse visualmente. El
movimiento no deberá provocar que las muestras toquen las paredes del pocillo. Los tiempos
de incubación se reducen, tal y como se indica a continuación, durante las incubaciones de
la muestra y del conjugado. El protocolo para el análisis de bazo y nódulo linfático de pequeños
rumiantes requiere que todas las incubaciones se hagan sin movimiento.
Protocolos de ensayo
Procedimiento de la prueba
Protocolo
Corto
Protocolo
Ultra-Corto
Protocolo Bazo y
Nódulo Linfático
de Pequeños
Rumiantes
Paso
1
2
3
4
5
Acción
Adición de la muestra
a la placa de dilución
Adición de la muestra
a la placa de captura
de antígeno
Incubación de la
placa de captura
Lavado con solución
1 de lavado 1X
Solución de
acondicionamiento:
Adición / Incubación
18–26°C
todos los pasos
32–37°C 1 :
Sólo incubaciones
(pasos 3,5,8,10)
18–26°C: El resto de
pasos, incluyendo
los pasos de lavado
Tejido cerebral: 120 μl de muestra con
30 μl de diluyente de la placa de trabajo.
18–26°C
todos los pasos
Nódulo linfático y
bazo de pequeños
rumiantes: 100 μl
de muestra con 50
μl de diluyente de
la placa de trabajo.
MEZCLE BIEN. Consulte la sección “Dilución de la
muestra en el diluyente de la placa de trabajo.
Pipetee 100 µl de muestra diluida sobre la placa de ensayo,
mezcle bien los controles, añada 100 µl por duplicado, cubra la
placa con una cubierta de placa.
45–60 min;
agitación lenta
200 ±100 rpm
20–25 min;
agitación lenta
200 ±100 rpm
2-3 horas sin
movimiento
Lave los pocillos 6 veces con ~350 µl de solución 1
de lavado 1X.
Añada 100 µl de la solución tamponada (buffer) de
acondicionamiento a cada pocillo, cubra la placa
e incúbela 10 ±1 min.
6
Lavado con solución
2 de lavado 1X
7 Adición de conjugado
8
Incubación de
conjugado
Lave los pocillos 3 veces con ~350 µl de solución 2
de lavado 1X.
Añada 100 µl de conjugado diluido (para tejido cerebral de
bovinos y nódulo linfático/bazo de pequeños rumiantes utilice
CC; para el tejido cerebral de pequeños rumiantes utilice
SRBCC) y cubra la placa con una cubierta de placa.
45–50 min. 25–30 min. 60–75 min.
9
10
11
Lavado con solución
2 de lavado 1X
Adición / Incubación
de sustrato
Adición de la
solución de parada /
Lectura de la placa
Lave los pocillos 5 veces con ~350 µl de solución 2
de lavado 1X.
Añada 100 µl de sustrato a cada pocillo, cubra la placa, incube
15 ±1 min. alejado de la luz solar directa (no utilice cubierta
adhesiva).
Añada 100 µl de solución ácida de parada; la placa puede
mantenerse hasta 30 min. en la oscuridad antes de leer la
densidad óptica a 450 nm utilizando una longitud de onda de
referencia (A REF
) de 620 nm ó de 650 nm.
1. La incubación a 32–37°C implica la colocación de la placa de ensayo en una incubadora precalentada a 32–37°C.
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