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Protocolli per l’esame Procedura del test Protocollo Breve Protocollo Ultra-Breve Protocollo milza/ linfonodi di piccoli ruminanti Passaggio 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Attività Aggiunta del campione alla piastra di diluizione Aggiunta del campione alla piastra di cattura dell’antigene Incubazione della piastra di cattura Lavare con soluzione 1 di lavaggio 1X Conditioner: Aggiunta/ Incubazione Lavare con soluzione 2 di lavaggio 1X Aggiunta del coniugato Incubazione del coniugato Lavare con soluzione 2 di lavaggio 1X Aggiunta/ Incubazione del substrato Aggiunta della soluzione di arresto/Lettura della piastra 18–26°C Tutti i passaggi 32–37°C 1 : Solo per l’incubazione (passaggi 3, 5, 8, 10) 18–26°C: Tutti gli altri passaggi, inclusi i passaggi di lavaggio Tessuto cerebrale: 120 μl di campione con 30 μl di diluente per piastra da lavoro. 18–26°C Tutti i passaggi Linfonodi e milza: 100 μl di campione con 50 μl di diluente per piastra da lavoro. MESCOLARE BENE: consultare il capitolo “Diluizione di un campione in un diluente per piastra da lavoro”. Pipettare 100 µl di campione diluito sulla piastra per l’esame; mescolare i controlli, aggiungere 100 µl in duplicato; coprire la piastra con un coperchio per piastre. 45–60 minuti; agitare lentamente a 200 ±100 rpm 20–25 minuti; agitare lentamente a 200±100 rpm 2–3 ore fermo Lavare i pozzetti 6 volte con ~350 µl di soluzione 1 di lavaggio 1X Aggiungere 100 µl di tampone di condizionamento a ciascun pozzetto; coprire la piastra; incubare per 10 ±1 minuti. Lavare i pozzetti 3 volte con ~350 µl di soluzione 2 di lavaggio 1X. Aggiungere 100 µl di coniugato diluito (per tessuto cerebrale bovino e linfonodi /milza di piccoli ruminanti usare CC; per tessuto cerebrale di piccoli ruminanti usare SRBCC) e coprire la piastra con l’apposito coperchio. 45–50 minuti 25–30 minuti 60–75 minuti Lavare i pozzetti 5 volte con ~350 µl di soluzione 2 di lavaggio 1X Aggiungere 100 µl di substrato a ciascun pozzetto; coprire la piastra; incubare per 15 ±1 minuti. Evitare l’esposizione diretta alla luce. (non usare coperture adesive) Aggiungere 100 µl di soluzione di arresto acido; la piastra può essere tenuta fino ad un massimo di 30 minuti al buio prima della lettura della densità ottica (450 nm) con una lunghezza d’onda di riferimento di (A REF ) 620 nm–650 nm. 1. L’incubazione a 32–37 °C viene eseguita posizionando la piastra di analisi in un incubatore preriscaldato a 32–37°C 46
Sommario delle procedure del test Campionamento e preparazione del tessuto: Siringua di raccolta dei campioni Tessuti cerebrali di bovino Tessuto cerebrale di piccoli ruminanti Tessuto linfonodale o di milza di piccoli ruminanti Si No No Tritare il tessuto No No Si Procedura del test: Coniugato concentrato CC SRB-CC CC Diluente per piastra di lavoro (Rapporto di diluzione con il campione) 30 µl/120 µl 30 µl/120 µl 50 µl/100 µl Protocolli approvati Breve & Ultra-Breve Breve & Ultra-Breve Milza & linfonodi di piccoli ruminanti Valore limite (cutoff) NCx + 0,120 NCx + 0,180 NCx + 0,180 Protocollo opzionale di calore Si No No Interpretazione dei risultati Affinché l’analisi possa essere considerata valida, la media del controllo negativo (NCx) deve corrispondere ad un valore A 450 – A REF inferiore a 0,150 e la media del controllo positivo (PCx) deve avere un valore A 450 – A REF ≥0,400. Calcoli Calcolo della media del controllo negativo (NCx): NCx = A1 (A 450 – A REF ) + B1 (A 450 – A REF ) Calcolo della media del controllo positivo (NCx): PCx = C1 (A 450 – A REF ) + D1 (A 450 – A REF ) Calcolo del valore limite: Cutoff per bovini = NCx + 0,120 Cutoff per piccoli ruminanti = NCx + 0,180 2 2 Nota: Vedere il passaggio 11 del protocollo di analisi per la definizione di A REF . Risultati L’interpretazione dei risultati si basa sull’assorbanza del campione. I campioni i cui valori A 450 – A REF sono inferiori al valore limite sono considerati negativi dal test IDEXX HerdChek BSE-Scrapie Antigen Test Kit. Il campioni i cui valori A 450 – A REF sono superiori o uguali al valore limite vengono classificati come inizialmente reattivi per PrP Sc e l’omogeneato devono essere rianalizzati in duplicato con il test IDEXX HerdChek BSE-Scrapie Antigen Test Kit. È possibile ripetere il test sul tessuto cerebrale bovino utilizzando l’iniziale omogenato tissutale o un omogenato preparato utilizzando il protocollo opzionale di calore per i bovini descritto di seguito. Se il campione analizzato in duplicato presenta valori ancora superiori o uguali al livello di cut off, allora il campione è da considerare positivo. Il campione è considerato negativo quando entrambi i valori dei replicati sono inferiori al valore limite del test. Nell’ambito della Unione Europea, tutti I 48 campioni inizialmente reattivi risultanti negativi con l’utilizzo del protocollo con trattamento termic possono essere considerati come negativi. Negli stati membri dell’Unione Europea, tutti i campioni e i tessuti corrispondenti che diano risultati del test positivi devono essere inviati al Laboratorio di riferimento nazionale per la conferma. 47
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