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Preparação de Reagentes
Soluções de Lavagem (Solução 1 de Lavagem, Solução 2 de Lavagem)
Os concentrados de solução de lavagem devem ser conservados à 18–26°C e devem ser
misturados para dissolver completamente quaisquer sais precipitados. Cada concentrado
de lavagem deve ser diluído na proporção de 1:10 em água destilada ou desionizada antes
da utilização (por ex., 40 ml de concentrado mais 360 ml de água por placa a ser avaliada).
Componente 2 de Diluição para Placas
O componente 2 de diluição para placas (D2) é fornecido como um composto liofilizado.
A solução é preparada adicionando 200 µl de Diluente de reconstituição (R), deixando
repousar durante aproximadamente 1 minuto e misturando suavemente. Utilizar no prazo
de 1 hora após preparação.
Diluente de Placa de Trabalho
O componente 1 de diluição para placas (D1) deve ser mantido à 18–26°C. Preparar a placa
de trabalho adicionando uma parte de componente 2 de diluição para placas (D2, preparado
como indicado acima) a 25 partes de componente 1 de diluição para placas (D1) e misturar
bem (por exemplo 120 µl D2 a 3,0 ml D1 por placa). É necessário aproximadamente 2,75
ml de diluente para placa de trabalho, por placa, ao testar amostras de tecido cerebral.
Os testes com nódulos linfáticos ou tecidos esplénicos requerem aproximadamente 5 ml
de diluente de placa de trabalho por placa. O diluente para placa de trabalho deve ser
preparado e usado no mesmo dia.
Controlos Negativos e Positivos
Os controlos negativos e positivos são fornecidos liofilizados. Reconstituir cada controlo,
adicionando 1 ml de tampão de reconstituição. Deixar a solução repousar durante
aproximadamente 1 minuto e depois misturar vigorosamente. Utilizar no prazo de 2 horas
após preparação. NÃO DILUIR OS CONTROLOS NEGATIVOS OU POSITIVOS EM
DILUENTE DE PLACA DE TRABALHO.
Soluções de Anticorpos Anti-PrP Conjugado com HRPO
As soluções de anticorpos anti-PrP conjugado com HRPO são preparadas diluindo a
solução concentrada de conjugado adequada (ver nota abaixo) no diluente tampão de
conjugado (CD), conforme indicado na etiqueta (por exemplo, uma diluição de 1:100
requer 120 µl de solução concentrada de conjugado para 12 ml de diluente tampão de
conjugado). Consultar a etiqueta da solução concentrada de conjugado para obter o factor
de diluição correcto. A solução de conjugado diluída deve ser preparada e utilizada dentro
de 4 horas.
NOTA IMPORTANTE: Existem duas soluções concentradas de conjugado disponíveis
para utilizar com este teste. Seleccionar a adequada para o tecido a ser testado:
• Solução concentrada de conjugado (CC)— Utilizar esta solução de conjugado
ao testar amostras de cérebro bovino ou amostras de nódulos linfáticos ou tecidos
esplénicos de pequenos ruminantes.
• Solução concentrada de conjugado para pequenos ruminantes (SRB-
CC)—Utilizar esta solução de conjugado ao testar tecidos cerebrais de ovinos ou
caprinos.
• As cavidades dos controlos negativos e positivos devem ser incluidas para cada
tipo de conjugado testado.
Solução ácida de paragem
A solução de paragem de teste não é fornecida com o kit de teste. A solução de paragem
(0,5–1,0 N HCl ou 1,0 N H 2 SO 4 ) pode ser adquirida numa concentração de trabalho ou
preparada a partir de una solução concentrada.
Os três protocolos abaixo descritos requerem que os reagentes se encontrem à 18–26°C
antes da utilização. Antes de iniciar o teste, preparar as soluções a serem utilizadas no
ensaio. Misturar todos os reagentes suavemente. Os controlos (negativo e positivo) devem
misturar-se vigorosamente e devem ser testados em duplicado. Deve ser utilizada uma
cobertura na placa, durante todo o ensaio.
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