HerdChek* BSE-Scrapie Antigen BOVINE SPONGIFORM ... - Defra

Utilização do agitador de placas para incubação da amostra (protocolos Curto e
Ultra-curto)
O protocol Curto e Ultra-curto, usado para teste de cérebro de bovinos e pequenos ruminantes,
envolve uma rotação lenta (200+-100rpm) em plataforma de agitador de placa somente para
o passo de incubação de amostra. O agitador de placa deve estar em movimento circular
levemente horizontal. Apesar da amostra se mover suavemente em cada orifício da placa,
isso poderá não ser visualmente aparente. O movimento não pode ser forte ao ponto de
mover a amostra para os lados dos orifícios. Os tempos de incubação diminuem de acordo
com as incubações de amostra e conjugado, conforme descrição na tabela seguinte.
O protocol de baço/linfonodo de pequenos ruminantes requer que todas as incubações sejam
fixas.
Protocolos do Ensaio
Procedimento de Teste
Protocolo
Curto
Protocolo
Ultra-curto
Protocolo baço /
nódulos linfáticos
de pequenos
ruminantes
Passo
1
2
3
4
5
6
7
8
Actividade
Adição de
amostra à placa
de diluição
Adição de
amostra na placa
de recolha de
antigénio
Incubação da
placa de captura
Lavagem com
solução de
lavagem 1 (dil)
Condicionador:
Adição/Incubação
Lavagem com
solução de
lavagem 2 (dil)
Adição de
Conjugado
Incubação de
Conjugado
18–26°C
Todos os
procedimentos
32–37°C 1 :
Apenas incubações
(passos 3,5,8,10)
18–26°C: Todos
os demais
procedimentos
incluindo
procedimentos de
lavagem
Tecido cerebral – 120 µl de amostra com
30 µl de diluente da placa de trabalho.
18–26°C
Todos os
procedimentos
Homogeinize bem – veja “Diluição da amostra
no Diluente da Placa de Trabalho”.
Linfonodo e baço –
100 µl de amostra
com 50µl de
diluente da placa
de trabalho.
Pipetar 100 µl de amostra diluída na placa de ensaio; misturar os
controlos, adicionar 100 µl em duplicado; cobrir a placa com uma
cobertura de placa.
45–60 min.;
agitação lenta 200
±100 rpm
20–25 min.;
agitação lenta
200 ±100 rpm
2–3 horas imóvel
Lavar os poços 6 vezes Utilizando ~350 µl por poço, em cada
lavagem, com solução de lavagem 1 (dil)
Adicionar 100 µl de solução tampão de condicionamiento em cada
poço; tapar a placa; incubar 10 ±1 min.
Lavar os poços 3 vezes Utilizando ~350 µl por poço, em cada
lavagem, com solução de lavagem 2 (dil).
Adicionar 100 µl de solução de conjugado diluída (cérebro
bovino e nó linfático/baço de pequenos ruminantes utilizam CC;
cérebro de pequenos ruminantes utiliza SRB-CC) e a placa com a
respectiva cobertura.
45–50 min. 25–30 min. 60–75 min.
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