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Preparazione dei reattivi
Soluzioni di lavaggio (Soluzione di lavaggio 1, Soluzione di lavaggio 2)
I concentrati delle soluzioni di lavaggio devono essere portati a 18–26°C e miscelati
per dissolvere eventuali sali precipitati. Prima dell’uso, ciascun concentrato di lavaggio
deve essere diluito in proporzione 1:10 con acqua distillata o deionizzata (es. 30 ml di
concentrato più 270 ml di acqua per piastra da analizzare).
Componente del diluente per piastra 2
Il componente del diluente per piastra 2 (D2) viene fornito sotto forma di composto
liofilizzato. La soluzione si prepara aggiungendo 200 µl di Diluente di ricostituzione (R),
lasciandola riposare per un minuto circa e quindi miscelandola con delicatezza. Usare entro
un’ora dalla preparazione.
Diluente per piastra di lavoro
Il diluente per piastra di lavoro 1 (D1) deve essere portato a 18–26°C. Preparare il diluente per
la piastra di lavoro attraverso l’aggiunta di una parte di componente del diluente 2 (D2) a 25
parti di componente 1 (D1) miscelare con cura (e.g.: 120 µl di D2 a 3,0 ml di D1 per piastra).
Quando si testano campioni di cervello per ogni piastra si utilizzano circa 2,75 ml di diluente
per piastra di lavoro. Quando si testano linfonodi o milza si utilizzano circa 5 ml di diluente
per piastra di lavoro. Il diluente per piastra di lavoro deve essere preparato ed utilizzato nello
stesso giorno.
Controlli negativo e positivo
I controlli negativo e positivo vengono forniti liofilizzati. Ricostituirli aggiungendo 1 ml
di Diluente di ricostituzione. Assicurarsi che la soluzione riposi per almeno un minuto e
poi miscelare vigorosamente. Usare entro due ore dalla preparazione. NON DILUIRE I
CONTROLLI NEGATIVO O POSITIVO NEL DILUENTE PER PIASTRA DI LAVORO.
Soluzione anticorpale contenente anticorpi anti PrP coniugata con HRPO
La soluzione per anticorpi anti-PrP coniugata con perossidasi (HRPO) viene preparata
diluendo l’appropriato coniugato concentrato (vedi la nota sotto) nel diluente del coniugato
(CD) come indicato nell’etichetta (per esempio, una diluizione 1:100 richiede 120 µl
di concentrato coniugato per 12 ml di diluente coniugato). Consultare l’etichetta del
concentrato coniugato per il fattore di diluizione corretto. Il coniugato diluito deve essere
preparato e usato entro quattro ore.
NOTA IMPORTANTE: sono disponibili due coniugati concentrati da utilizzare per il
test. Selezionate quello corretto per il tipo di tessuto che dovete testare:
• Coniugato concentrato (CC)—Utilizzate questo coniugato quando testate
campioni di cervello bovino o campioni di milza e linfonodi di piccoli ruminanti.
• Coniugato concentrato per cervello di piccoli ruminanti (SRB-CC)—Utilizzate
questo coniugato quando testate tessuti cerebrali di pecora o capra.
• I pozzetti del siero di controllo negativo e positivo devono essere inclusi per ogni
tipo di coniugato testato.
Soluzione di arresto acido
Il kit non contiene la soluzione di arresto necessaria per l’esecuzione dell’analisi.
La soluzione di arresto (0,5–1,0 N HCl o 1,0 N H 2 SO 4 ) può essere acquistata alle
concentrazioni di lavoro o preparata utilizzando il concentrato.
Tutti i tre protocolli descritti di seguito richiedono che i reagenti siano a 18–26°C prima
dell’uso. Prima di iniziare l’analisi, preparare le soluzioni da utilizzare nel dosaggio.
Miscelare i reattivi agitandoli con delicatezza in senso circolare. Miscelare vigorosamente
i controlli. I controlli (negativo e positivo) sono analizzati in duplicato. Utilizzare l’apposito
coperchio per coprire la piastra per tutta la durata dell’analisi.
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