doktori témaösszefoglalók - Környezettudományi Doktori Iskola ...

Baka Erzsébet, 2008, nappali
Mutagenezis rendszer fejlesztése a termoacidofil Thermoplasma acidophilum modelszervezet
molkuláris biológiai vizsgálatához
Témavezetı: Dr. Kukolya József, tudományos munkatárs, C.Sc.
Dr. Kriszt Balázs, tanszékvezetı, egyetemi docens, Ph.D.
A téma aktualitása, jelentısége:
A Thermoplasma acidophilum az archaebaktériumok közé tartozó extrém körülmények között élı
prokarióta, mely az elmúlt évtizedben a proteomika modellszervezetévé vált. A mai napig nem teljesen feltárt,
hogy a baktérium hogyan képes extrém (pH:1, 60 o C) körülmények között élni sejtfal nélkül. A baktérium
molekuláris biológiai vizsgálatait több tényezı is jelentısen hátráltatja, többek között, nem megoldott a
szilárd táptalajon való tenyésztés, ezáltal a genetikai manipulációs eszközei is hiányosak és fejlesztésre szorulnak.
A projekt célkitőzéseinek sikeres teljesítése esetén egy sor genetikai konstrukció- és ismeretlen fehérjék
funkció analízisére alkalmas KO mutagenezis rendszer kidolgozása kezdıdne el a müncheni Max Planck
Intézet Struktúrbiológiai Tanszékének irányítása és felügyelete mellett.
Célkitőzések:
a. A T. acidophilum tenyésztés szilárd táptalajon, az táptalaj optimalizálása
b. Antibiotikum rezisztenciát (novobiocin) kódoló T. acidophilum plazmid kialakítása
c. Homológ rekombinációs rendszer kialakítása, a novobiocin rezisztenciáért felelıs giráz gén módosítása
helyspecifikus mutagenezissel
d. Génpuska alkalmazása transzformációs célokra
e. Mutáns génkonstrukciók bevitele
f. Alegységszervezıdéső enzimek (peroxiredoxin, SOD) struktúrfehérjéinek klónozása
Elvégzett kutatómunka és fıbb eredményei:
1) Elızetes kísérletek elvégzése génpuskával, E.coli transzformálása, a befolyásoló tényezık optimalizálása
(DNS koncentráció, baktérium sejt-koncentráció, nyomás, lövési távolság, lövések száma).
Arany és magnetit mikrohordozók tesztelése, optimalizálása.
2) A T. acidophilumból izolált kriptikus plazmidon (pTA1) helyspecifikus mutagenezis végrehajtása,
mely segítségével az novobiocin rezisztencia jelentısen megnı. A mutagenezis eredményességének
igazolása szekvencia analízissel.
3) Gelrite alapú szilárd táptalaj elkészítése.
További teendık:
1) Szilika-bázisú táptalaj elkészítése, fejlesztése. Különbözı szénforrások tesztelése.
2) T. acidophilum transzformálás génpuska segítségével, a transzformáció fı paramétereinek optimalizálása.
3) Novobiocin rezisztens T. acidophilum sejtvonalak elıállítása, az antibiotikum rezisztencia pontos
jellemzése, a novobiocin érzékenység összevetése a mutáns és a vad sejtvonalakon.
2008. évben közlésre elfogadott és megjelent fontosabb publikációk jegyzéke:
András Táncsics, Sándor Szoboszlay, Balázs Kriszt, József Kukolya, Erzsébet Baka, Károly Márialigeti,
Sára Révész. Applicability of the functional gene catechol 1,2-dioxygenase as a biomarker in the detection
of BTEX-degrading Rhodococcus species. Journal of Applied Microbiology 2008 Oct;105(4):1026-
33.
András Táncsics, István Szabó, Sándor Szoboszlay, Erzsébet Baka, Károly Márialigeti, Sára Révész. The
role of Beta-Proteobacteria in aromatic hydrocarbon degradation: fingerprinting of 16S rRNA gene and
catechol 2,3-dioxygenase gene by T-RFLP in BTEX degradative bacterial communities. Current
Research Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology (accepted chapter) (2008).
68