CamSep 3 S
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
ZASTOSOWANIE CHROMATOGRAFII W ANALIZIE STRUKTURY<br />
O-POLISACHARYDÓW BAKTERII PECTOBACTERIUM ATROSPETICUM<br />
Małgorzata CZERWICKA * , Jolanta KUMIRSKA, Jerzy GAJDUS,<br />
Anna BYCHOWSKA, Kinga MARSZEWSKA, Jadwiga WIŚNIEWSKA,<br />
Piotr STEPNOWSKI, Zbigniew KACZYŃSKI<br />
/sączenie molekularne, chromatografia gazowa/<br />
Wydział Chemii, Uniwersytet Gdański, ul. Sobieskiego 18/19, 80-952 Gdańsk<br />
*e-mail: margo@chem.univ.gda.pl<br />
Bakterie należące do rodzaju Pectobacterium atakują ważne z gospodarczego punktu<br />
widzenia gatunki roślin takie jak: ziemniaki, trzcina cukrowa, marchew, pomidory, ananasy oraz<br />
niektóre rośliny ozdobne. Bakterie gatunku Pectobacterium atrosepticum związane są głównie z<br />
infekcjami ziemniaków. Powodują one więdnięcie i żółknięcie całej rośliny bądź tylko podstawy<br />
łodygi tzw. czarna nóżka, a także gnicie sadzeniaków podczas ich przechowywania. Gatunek<br />
Pectobacterium atrosepticum po raz pierwszy został opisany w 1902 roku przez van Hall’a jako<br />
Bacillus atrosepticus. W literaturze najdłużej był opisywany jako podgatunek Erwinia carotovora<br />
subsp. atroseptica. Już w 1945 roku zaproponowano zaklasyfikowanie tych pektynolitycznych<br />
Gram-ujemnych bakterii do nowego rodzaju Pectobacterium. Propozycja ta jednak została<br />
zaakceptowana dopiero pod koniec lat 90-tych ubiegłego wieku. Trudności z identyfikacją<br />
i klasyfikacją baterii rodzaju Pectobacterium, świadczą o występowaniu w tej grupie dużej<br />
heterogenności, a obowiązujący w tej chwili podział taksonomiczny z całą pewnością nie jest<br />
ostateczny. W diagnostyce oraz identyfikacji gatunków i podgatunków bakterii rodzaju<br />
Pectobacterium nie wykorzystano dotychczas pełnej struktury antygenów O-polisacharydowych.<br />
Określenie struktury pierwszorzędowej powtarzalnych jednostek polisacharydowych antygenów<br />
bakteryjnych jest procesem praco- i czasochłonnym, w którym istotną rolę odgrywają techniki<br />
chromatograficzne.<br />
Z trzech wybranych szczepów bakteryjnych (Pectobacterium atrosepticum SCRI 1039,<br />
Pectobacterium atrosepticum SCRI 1043, Pectobacterium atrosepticum SCRI 1055) wyodrębniono<br />
i oczyszczono O-polisacharydy (OPS-y). W tym celu wykonano ekstrakcję suchej masy bakteryjnej<br />
z zastosowaniem różnych metod (np. w układzie fenol-woda, fenol-chloroform-eter naftowy),<br />
usunięto kwasy nukleinowe, wyizolowano lipopolisacharydy, które następnie poddano hydrolizie<br />
i po usunięciu lipidu A wydzielono frakcje polisacharydowe z zastosowaniem metody sączenia<br />
molekularnego (GPC - gel permeation chromatography). Następnie zidentyfikowano wchodzące<br />
w skład OPS-ów reszty cukrowe, określono konfiguracje anomerycznych atomów węgla, wielkości<br />
pierścieni cukrowych, przynależność do szeregu konfiguracyjnego D lub L, sposób i kolejność<br />
powiązania reszt cukrowych oraz rodzaj i miejsce występowania podstawników niecukrowych.<br />
W tym celu skorzystano z klasycznych metod chemicznych takich jak: analiza cukrowa, analiza<br />
metylacyjna (metody: Ciukanu-Kerek’a i Hakomori), reakcja z optycznie czynnym (S)-(+)-butan-2-<br />
olem, de-O-acetylacja. Uzyskane w wyniku powyższych reakcji chemicznych produkty poddano<br />
analizie jakościowej i ilościowej z wykorzystaniem techniki chromatografii gazowej<br />
oraz chromatografii gazowej połączonej ze spektrometrią mas. Dla otrzymanych O-polisacharydów<br />
wykonano pełną interpretację zarówno widm jednowymiarowych<br />
1 H i<br />
13 C NMR,<br />
jak i dwuwymiarowych homokorelacyjnych COSY, TOCSY, NOESY oraz heterokorelacyjnych:<br />
HSQC, HMBC i HMQC-TOCSY. Wyniki uzyskane metodami chemicznymi oraz analiza kompletu<br />
widm NMR były podstawą do określenia I-rzędowej struktury wszystkich wyodrębnionych antygenów<br />
powierzchniowych.<br />
49
Change language