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Forschung 4
Abb2: Mittels Robotertechnik werden die exprimierten
und aufgereinigten rekombinanten Proteine auf Chips
aufgebracht. Anschließend können verschiedene Analysen
direkt auf dem Chip durchgeführt werden.
Proteinproben von A. thaliana werden über hochauflösende 2D-Gele aufgetrennt. Über automatisierte Verfahren
werden die Proteinspots ausgestochen (Abb. 3), die Proteine aus dem Gel isoliert und schließlich auf entsprechende
Träger zur MS-Analyse aufgebracht. (Abb. 4)
tionen sowie die Sequenzen.
Die eigentlichen DNA-Arrays werden auf Glas-
Slides hergestellt, wobei Split-Pins zum Spotten
der DNA verwendet werden. Im Vergleich zu
cDNA- und Oligo-Chips, die bereits von zwei Firmen
angeboten werden, liegt der Vorteil des
CATMA-Chips in der Verwendung von gen-spezifischen
Fragmenten in einer Länge von 150 bis
500 Nukleotiden, die eine stringentere und spezifischere
Hybridisierung erlauben.
Folgende Gruppen gehören zum CATMA-Konsortium:
Pierre Hilson (Gent, Belgien), Paul van Hummelen
(Leuven, Belgien), Pierre Rouzé (Gent, Belgien),
Vincent Colot (Evry, Frankreich), Wilfried
Nietfeld (Berlin, Deutschland), Jim Beynon (Wellesbourne,
England), Martin Trick (Norwich, England),
Peter Weisbeek (Utrecht, Holland), Philippe
Reymond (Lausanne, Schweiz), Sean May
(Nottingham, England), Javier Paz-Ares (Madrid,
Spanien), Rishikesh Bhalerao (Umea, Schweden)
Analyse von Pflanzenproteinen
mittels Massenspektrometrie
(Johan Gobom, Niklas Gustavsson,
Joachim Klose, Patrick Giavalisco,
Beata Lukaszewska, Yvonne Kläre,
Irmgard Römer)
In den letzten Jahren sind grundlegende
Fortschritte in der massenspektrometrischen
Analyse von Proteinen erzielt worden. Besonders
die ‚Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionization
Mass Spectrometry’ (MALDI-MS) eröffnet die
Möglichkeit, die Primärstruktur von Proteinen
aus hochauflösenden 2D-Gelen (2DE) schnell
und präzise zu ermitteln.Tatsächlich erfolgte der
endgültige Durchbruch für die Anforderungen
der modernen Proteomics-Forschung mit der
Einführung der MALDI-MS-Technik durch Karas
und Hillenkamp (1988) und Tanaka et al. (1988)
sowie mit der Elektrospray-Massenspektrometrie
(ESI-MS) im Jahre 1989. Die herausragende
Entwicklung auf dem Gebiet der «sanften» Ionisierungs-Technik
ist dieses Jahr mit dem Nobel-
Preis in Chemie für John B. Fenn und Koichi Tanaka
geehrt worden.
Im Rahmen des LAPP-Teilprojektes 2DE/MS, welches
in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von
Prof. Klose (Charité, Berlin) bearbeitet wird, sollen
die technologischen Ressourcen für die
Hochdurchsatz-Analyse von Proteinen auf der
Grundlage von 2DE-Gelen und MALDI-MS geschaffen
werden. Die Techniken und Methoden
können dann in anderen GABI-Projekten sowie
in pflanzenbiotechnologisch orientierten Unternehmen
genutzt werden.
Aufgrund der Tatsache, dass MALDI-MS relativ
robust auch bei geringen Verunreinigungen mit
Salzen oder niedermolekularen Substanzen
funktioniert, ist die Probenvorbereitung gut automatisierbar.
Zudem kann die MALDI-MS Probenverarbeitung
sowie die –messung wesentlich
schneller durchgeführt werden als mit ESI-MS.
Die MALDI-MS-Technik ermöglicht es dem Forscher
auf diese Weise, Hunderte von Proteinproben,
die z.B. auf einem hochauflösenden 2DE-
Gel voneinander getrennt worden sind, zu identifizieren.
Die zweite grundlegende Technik, die für erfolgreiche
Proteomics-Forschung notwendig ist, ist
die 2D-Gelelektrophorese, eine Methode, die
von Joachim Klose und Patrick O'Farrell im Jahr
1975 unabhängig voneinander entwickelt und
veröffentlicht worden ist. Fortlaufende technische
Verbesserungen im Labor von Prof. Klose
(Charité, Berlin) resultierten in der Entwicklung
einer Technik, die große 2D-Gele verwendet, auf
denen über 10.000 Proteinspots eines Gewebes
in einem einzigen Gel aufgetrennt werden können
(Klose und Kobalz, 1995). Die Basis für die
hohe Auflösung ist eine Extraktionsmethode, die
mit einer Fraktionierung der Probe verbunden ist
(entwickelt von der Gruppe von Prof. Klose,
1999). Während die meisten Extraktionsmethoden
auf Präzipitation und anschließender erneuter
Lösung der Proteine beruhen, vermeidet die
auf Fraktionierung basierende Methode alle Präzipitationsschritte.
Es wird statt dessen eine sequentielle
Behandlung der Proben mit unterschiedlichen
Puffern durchgeführt, mit Hilfe
derer unterschiedliche Proteinklassen, z.B. in
Wasser oder Detergenzien lösliche Proteine sowie
Nukleinsäure-assoziierte Proteine extrahiert
werden können. Die aus den hochauflösenden
2D-Gelen können nun mittels Robotertechnik im
Hochdurchsatzverfahren aufgearbeitet und für
die MS-Analyse eingesetzt werden.
Expressionsbanken und
Proteinchips von Arabidopsis
und Gerste
(Birgit Kersten, Tanja Feilner,
Alexandra Possling, Silke Wehrmeyer,
Armin Kramer)
Protein-Arrays erschienen erst vor kurzem
als neue Methode, um ein gerichtetes Screening
von rekombinanten Proteinen auf deren
Expression und ihre molekularen Interaktionen
im Hochdurchsatz zu ermöglichen. Außer auf
herkömmlichen Trägern wie Mikrotiterplatten
und Membranfiltern sind Proteinarrays neuerdings
auch im Chipformat hergestellt worden.
Verschiedene Anwendungen für Proteinchips
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