Biochemiepraktikum

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Biochemie Praktikum: Proteinchemie
I. Homogenisierung
Die Schweineherzen werden von Fettgewebe, Haut und Sehnen befreit und in kleine
Stückchen zerteilt.
Zum Homogenisieren der Herzen wird zuerst Wasser und Eis (jeweils etwa gleiches Volumen
wie zerkleinerte Herzen) im Mixer homogenisiert. Danach wird das Herz in kleinen Portionen
zugegeben und auf höchster Stufe gemixt (max. je 1 min am Stück). Das homogenisierte Herz
wird auf Zentrifugenbecher verteilt, tariert und bei 8000 U / min und 4°C 15 min lang
abzentrifugiert. Der Überstand wird über Glaswolle von Fett und Zellfragmenten in eine
gekühlte Vorlage abfiltriert. Mit dem Filtrat wird weitergearbeitet:
Bestimmung von Gesamtvolumen, Proteinkonz., Volumenakt., spez. Akt. und Gesamtaktivität.
1 ml Probe für SDS-Versuch in beschriftetes Eppi füllen und auf Eis lagern.
II.
Adsorption an Diethylaminoethyl(DEAE)-Cellulose und nachfolgende
Desorption
Unter Kühlung werden Portionsweise unter Rühren 20 g DEAE-Cellulose zum Filtrat
gegeben. Nach Zugabe wird noch ca. 5 Minuten weitergerührt und zum vollständigen Binden
mind. 45 Minuten inkubiert. Danach wird die Suspension abgenutscht und mit wenig dest.
Wasser (10 ml) gewaschen.
Das Filtrat wird einem Aktivitätstest und einer Volumenbestimmung unterzogen. Falls die
Gesamtaktivität des Filtrats 5 % der Gesamtaktivität nach der Homogenisierung übersteigt,
muss zum Filtrat weitere DEAE-Cellulose (4 g) zum Binden der verbliebenen LDH
zugegeben werden. Diese Schritte werden solange wiederholt, bis das Filtrat eine
Gesamtaktivität kleiner gleich 5 % der Gesamtaktivität nach der Homogenisierung erreicht
hat.
Die Cellulose wird mit 50 ml gekühltem 30 mM Phosphatpuffer pH 7.2 gewaschen, um
schwach gebundene Proteine zu entfernen.
Zur Desorption wird die Cellulose in einem Becherglas unter Kühlung mit 80 ml
eisgekühltem 250 mM Phosphatpuffer pH 7.2 versetzt und unter intensivem Rühren
aufgeschlämmt. Diese Aufschlämmung wird abgenutscht (Filter vorher anfeuchten, notfalls
mehrmals wechseln) und mit wenig Puffer gespült.
Das Filtrat wird einem Aktivitätstest unterzogen. Falls die bestimmte Gesamtaktivität unter
70 % der Gesamtaktivität nach der Homogenisierung liegt, muss ein weiteres Mal mit 40 ml
gekühltem 250 mM Phosphatpuffer pH 7.2 desorbiert werden.
Bestimmung von Gesamtvolumen, Proteinkonz., Volumenakt., spez. Akt. und Gesamtaktivität.
1 ml Probe für SDS-Versuch in beschriftetes Eppi füllen und auf Eis lagern.