Biochemiepraktikum

präparierten Proteinproben werden 15 µl und vom Markerprotein-Mix 3 µl in die Taschen
geladen und anschließend eine konstante Stromstärke von 25 mA/Gel angelegt. Nach
Eintreten der Proben in das Trenngel kann die Stromstärke auf 40 mA/Gel erhöht werden.
Immunoblotting (Western-Blotting) und Immunodetektion
- Theorie
Mit Western-Blotting können Antigene spezifisch durch poly- und monoklonale Antikörper
erkannt und damit sichtbar gemacht werden. Proteinproben werden beim SDS-PAGE mit
Hilfe von Detergenzien wie Sodiumdodecylsulfat (SDS) und reduzierenden Reagenzien wie
Dithiothreitol (DTT) oder 2-Mercaptoethanol (β-ME) solubilisiert und denaturiert.
Anschließend werden die Proteine durch SDS-PAGE Gelelektrophorese aufgetrennt und mit
Hilfe einer Semi-Dry Blotting Apparatur auf eine Nitrozellulose, PVDF oder Nylonmembran
transferiert. Die auf der Membran gebundenen Proteine können dann bei Verwendung einer
Nitrozellulosemembran durch reversible Anfärbung mit Ponceau S-Lösung sichtbar gemacht
werden.
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