Biochemiepraktikum

Integrative Hefetransformation - ein Überblick
Mit der Entdeckung von Methoden (1978) zur Einführung beliebiger DNA-Moleküle in die
Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae („Hefetransformation“) begann die rasante
Entwicklung dieses Mikroorganismus zu einem modernen, sehr vielseitigen
Experimentalsystem, an dem heute viele Prozesse einer Eukaryontenzelle modellhaft
untersucht werden.
Neben Plasmiden, die sich aufgrund autonom replizierender Sequenzen (ARS, 2µ) in
Hefezellen vermehren und als zirkuläre Moleküle an Tochterzellen weitergegeben werden,
können auch lineare DNA-Fragmente in Hefe transformiert und dabei direkt ins Genom der
Zelle eingebaut werden. Voraussetzung für diese „integrative Transformation“ ist eine enge
Sequenzverwandschaft des eingeführten DNA-Fragments zu einem Abschnitt des
Wirtsgenoms, so dass zwischen dem Fragment und diesem sequenz-identischen Bereich eines
Chromosoms Rekombination („Cross-over“) möglich ist. Als Ergebnis dieser Interaktion, die
den Gesetzen der Basenpaarung komplementärer DNA-Stränge folgt und durch eine Palette
wirtskodierter Rekombinationsenzyme unterstützt wird, kann das DNA-Fragment in die
Zielsequenz integrieren und als „normaler“ Teil dieses Chromosoms repliziert und vererbt
werden. Die Versuche dieses Praktikums stellen drei besonders häufig angewandte Spielarten
der integrativen Hefetransformation vor: Gen-Disruption, „pop-in/pop-out“ und „gap repair“.
Bei der Disruption ist beabsichtigt, den Leserahmen („ORF“) eines ausgewählten Zielgens
durch Einfügen zusätzlicher DNA-Sequenzen (typischerweise ein Markergen, auf dessen
Anwesenheit in der Wirtszelle selektioniert werden kann) zu zerstören und damit dieses Gen
gezielt zu inaktivieren. Im hierzu notwendigen Disruptionsallel, das in vitro hergestellt wird,
ist die DNA des Markergens von Sequenzen des Zielgens flankiert, die nach der
Transformation in die Wirtszelle mit der chromosomalen Kopie des Zielgens rekombinieren
und damit den Einbau des Disruptionsmarkers in das ursprüngliche intakte Gen herbeiführen.
Beim „pop-in/pop-out“-Verfahren wird üblicherweise ein Plasmid verwendet, das nicht
autonom replizieren kann („integratives Plasmid“, YIp). Auf dem Plasmid kann sich z. B. eine
durch in-vitro-Mutagenese veränderte Version eines Gens befinden, die nach der
Transformation die Wildtyp-Version des Genoms ersetzen soll („gene replacement“). Im
ersten Schritt, der sich durch ein ebenfalls auf dem Plasmid befindliches Markergen
selektionieren lässt, integriert das gesamte Plasmid ins Chromosom durch Rekombination
innerhalb homologer Sequenzbereiche. Dabei entsteht auf dem Chromosom eine Tandem-
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