Biochemiepraktikum

9. Tag
Plasmidisolation aus E. coli ("Koch-Minipräp“), Restriktionsanalyse
Die in E. coli geretteten Plasmide müssen nun wieder isoliert werden, um sie durch
Restriktionsverdauung zu analysieren.
Aus dem Stamm DH5α lassen sich Plasmide nach einer alternativen Prozedur präparieren, bei
der die Denaturierung der Hauptmasse an Proteinen und chromosomaler DNA durch Kochen
der enzymatisch aufgeschlossenen Zellen bewirkt wird. (Diesem Stamm fehlt eine Mg 2+ -
abhängige DNAse, die bei der Koch-Minipräp-Methode mitisoliert würde und während eines
Restriktionsverdaus sämtliche Plasmid-DNA degradieren würde.)
Lösungen: STET-Puffer: 8 g Glucose
5 ml Triton X-100
5 ml 1 M Tris/HCl pH 8,0
10 ml 0,5 M EDTA pH 8,0
80 ml H 2 O
STET/Lysozym:
1 mg Lysozym (90000 U/mg)
in 2,2 ml STET-Puffer lösen (frisch ansetzen !)
- Je ein Eppendorf-Gefäß mit E. coli-Kultur ganz auffüllen, ca. 30 sec zentrifugieren,
Überstände in Bio-Müll-Sammelgefäß überführen
- E. coli-Zellsedimente durch Vortexen in 350 µl STET-Puffer resuspendieren
- 350 µl STET/Lysozym zugeben, durchmischen, Gefäße in 100 °C heißen Heizblock
setzen, Deckel mit Nadel durchstechen und exakt 3,5 min inkubieren
- Proben für 10 min in Eiswasser stellen (denaturiertes Zellmaterial fällt flockig aus)
- 10 min zentrifugieren
- das schleimige Zentrifugat mit dem breiten Ende eines Zahnstochers herausfischen
und zum Überstand etwa das gleiche Volumen Isopropanol geben (400-600 µl)
- 5 min zentrifugieren
- Überstand vollständig (!) mit spitz ausgezogener Pasteurpipette absaugen, Sediment
(oft kaum sichtbar) in 50 µl TE-Puffer + 1 µl RNAse (1 mg/ml) lösen
Abschließend werden die präparierten Plasmid-DNAs (einschließlich der Referenz-Plasmide)
mit BglII verdaut (je 5 µl DNA in 20 µl Gesamtvolumen mit 2 Units Enzym; Mastermix
anfertigen!) und im Agarose-Gel neben einem Längenstandard aufgetrennt.
Berechnen Sie anhand der Plasmid-Karte die erwarteten Bandengrößen (mit und ohne gap
repair) und vergleichen Sie damit die auf dem Gel-Foto vorliegenden Bandenmuster!
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