Biochemiepraktikum

0,5 % Ammonium-Sulfamat in 1 M HCl
0,05 % N-1-Naphthyl-ethylendiamin in 47 % Ethanol (Handschuhe!)
- Platten im Abzug mit 20 ml der Nitritlösung übergießen
- 5 min einwirken lassen, Lösung abgießen
- entsprechend mit der Sulfamatlösung verfahren (zur Reduktion des überschüssigen NO+,
warum?)
- Naphthyl-ethylendiamin-Lösung einwirken lassen, bis sich Kolonien mit CPY-Aktivität
deutlich rot färben (max. 5 min), in Sammelbehälter abgießen
B) Vermehrung von Einzelkolonien des "gap-repair"-Versuchs
Um für die DNA-Isolation am folgenden Tag genug Zellmaterial zur Verfügung zu haben,
wird von 2 der 4 "gestreakten" Klonen jeweils eine Einzelkolonie als "patch" auf eine frische
CM His- Platte übertragen.
Achtung: große Patches anlegen!
C) Ausstreichen der Integranten-Klone auf 5-FOA Platten
Die auf YPD-Medium gewachsenen Integranten-Klone (alle 8) werden auf einer MV-5-FOA
Platte zu Einzelkolonien ausgestrichen.
In Anwesenheit von 5-FOA (5-Fluor-Orotsäure) werden alle Zellen, die das URA3 Gen
enthalten, absterben. Das Ura3 Protein wandelt diese Droge in 5-Fluor-Uracil um, welches im
weiteren Pyrimidin-Syntheseweg als Selbstmord-Inhibitor wirkt und somit die Zellen
vergiftet. Durch diese Gegenselektion überleben (in Anwesenheit von Uracil im Medium) also
nur Klone, die durch homologe Rekombination im duplizierten CPY-Gen das URA3-
Markergen verloren haben. Diese werden nach ca. 2 Tagen als Einzelkolonien in den "streaks"
auf MV-5-FOA sichtbar.
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