Biochemiepraktikum

12. Tag:
Enzymatische Aktivität von CPY in verschiedenen Zellextrakten
Die enzymatische Aktivität der CPY soll in folgenden Hefestämmen bestimmt werden:
1 W303-1B PRC1
2 YWH1A prc1::LEU2
3 W303-1C prc1-1 (CPY*)
Da die Expression der CPY durch stickstoffreiches Medium sowie durch Glucose gehemmt
wird, wurden alle Hefestämme für diesen Versuchsteil auf Mineralmedium angezogen. Die
Zellen müssen mit Hilfe von Glasperlen mechanisch aufgeschlossen werden. Anschließend
erfolgt die Bestimmung des Proteingehalts und der Aktivitätstest.
Achtung: Die Hefezellen bzw. Rohextrakte müssen ständig auf Eis aufbewahrt werden!
- Glasperlenaufschluss
- von jedem Hefestamm werden 2 ml Zellsuspension in ein 2 ml Eppendorfhütchen gefüllt
und ca. 30 - 60 Sekunden abzentrifugiert (14 000 Upm),
Überstand abpipettieren
- Zu jedem Hefestamm 200 µl H 2 O sowie 200 µl Glasperlen geben; (200 µl H 2 O in ein
Hütchen füllen, markieren, ausschütten, als Messbecher für Glasperlen benutzen)
- Auf einem Rüttler 6 x 1 min kräftig mixen, dazwischen je 1 min auf Eis stellen
- 2 min Zentrifugieren (14 000 Upm), Überstand vorsichtig abpipettieren und in neue
Hütchen überführen, auf Eis aufbewahren, Pellet wegwerfen
- Proteinbestimmung [Lit.: M.M. Bradford, Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976)]
Neben der Proteinbestimmung nach der Biuret- bzw. Lowry-Methode stellt die Bestimmung
nach Bradford eine geeignete Möglichkeit dar, auch sehr kleine Proteinkonzentrationen zu
ermitteln. Sie beruht auf der Bindung des Farbstoffs Coomassie-Brilliant-Blue G-250 (s.
Abb.) an das Protein. Dabei wird das Absorptionsmaximum des Farbstoffes von 465 nm nach
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