Biochemiepraktikum

nach dem Ort, an dem die Rekombination initiiert wurde, kann entweder das Wildtyp- oder
das Mutanten-Allel zurückbleiben. Über CPY-Aktivitätstests wird am Ende des Versuchs
unter den 5-FOA-resistenten Klonen zwischen beiden Möglich-keiten diskriminiert.
Plasmid III (p313-up/down)
Dieses Plasmid basiert auf dem shuttle-Plasmid pRS313, welches sowohl in E. coli als auch in
Hefe repliziert wird. Für die Vermehrung in Hefe enthält es eine ARS (autonomous replication
sequence). Ein CEN (centromere)-Abschnitt sorgt zudem für eine niedrige Kopienzahl und
eine stabile mitotische Verteilung. Das selektionierbare Markergen ist in diesem Fall HIS3.
Insertiert in diesen shuttle-Vektor sind zwei DNA-Abschnitte, die im Hefegenom den
kodierenden Bereich des CIC1-Gens umschließen. Diese beiden Abschnitte wurden so
gewählt, dass der 5' gelegene mit einer EcoRV Schnittstelle endet und der 3' gelegene mit
einer EcoRV Schnittstelle startet, und wurden über Ligation der EcoRV-Restriktionsenden im
Plasmid miteinander fusioniert. Nach Linearisierung des Plasmids mit EcoRV werden beide
Stücke voneinander getrennt und ihre freien Enden können in Hefezellen an den homologen
Regionen jeweils Rekombinationsereignisse einleiten. Dabei kommt es entweder zur
Intergration des Plasmids, welche sich wegen des entstehenden dizentrischen Chromosoms
letal auswirkt, oder zur Überschreibung des "fehlenden" CIC1-Genbereichs ins Plasmid und
zur Plasmid-Rezirkularisierung. Auf dieses Ereignis wird durch Weglassen von Histidin im
Wachstums-medium selektioniert. Aus den Histidin-autotrophen Transformanten wird dann
die Gesamt-DNA isoliert und in E. coli geschleust. Von E. coli aufgenommene Plasmide, auf
die über die Ampicillin-Resistenz selektioniert wird, werden schließlich durch
Restriktionsanalyse mit EcoRV oder BglII auf die erfolgreiche Rekombination hin untersucht,
d.h. auf die Aufnahme eines Hefe-DNA-Abschnitts, der im Ausgangsplasmid nie vorhanden
war.
Überblick und Zeitplan zu den einzelnen Versuchsschritten:
a) Disruption
1. Tag: Plasmid-Isolation aus E. coli durch "Alkali-Minipräp", Verdau mit BglII/KspI
(KspI ist ein Isoshizomer von SacII), Überprüfung des Verdaus
2. Tag: Transformation von WCG4 mit dem Verdau, Ausplattieren auf CM Leu--
Platten
4. Tag: 10 Transformanten auf CM Leu--Platte "patchen", mit Vergleichsstämmen!
5. Tag: replikaplattieren der Transformanten auf CM Leu--Platte mit Rundfilter,
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