Biochemiepraktikum

Aktivitätstest
Das Enzym setzt aus dem farblosen Aminosäurederivat Benzoyl-Tyrosyl-p-Nitroanilid
(BTpNA) das gelbe p-Nitroanilin frei, dessen Extinktion photometrisch bei 405 nm bestimmt
werden kann.
Struktur von BTpNA
Der Test wird in Eppendorfhütchen angesetzt. Für jeden Hefestamm werden 300 µg Protein
eingesetzt. Die Reaktionslösung wird vor Zugabe des Substrates 2 min bei 14000 Upm
zentrifugiert. 1150 µl werden in Plastikküvetten überführt und die Reaktion durch Zugabe des
Substrates initiiert.
Testpuffer (100 mM Tris, pH 7,6) 900 µl
Rohextrakt (unverdünnt!)
x µl (max. 120 µl)
Wasser 120-x µl
DMF 150 µl
5 min bei RT inkubieren, abzentrifugieren 1170 µl
dann vom Überstand 1150 µl in Küvette überführen
Reaktion starten durch Zugabe von Substrat (3 mM BTpNA in DMF) 50 µl
Das Substrat wird direkt in die Lösung pipettiert, da DMF sonst die Plastikküvette anlöst. Der
Ansatz muss nach dem Pipettieren gemischt werden. Der Blindwert wird mit Wasser statt mit
Rohextrakt angesetzt. Gemessen wird gegen den Blindwert als Nullwert (für jeden
Zeitpunkt!).
Nach 0, 1, 2, 5, 10, 15, 30, 45 und 60 Minuten wird die Extinktion der Proben photometrisch
bei 405 nm gemessen. Mit Hilfe eines E/t-Diagrammes lässt sich die Extinktionsänderung der
Proben und damit die CPY-Aktivität in den einzelnen Rohextrakten bestimmen.
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